改进的QuEChERS法测定大豆中三嗪类除草剂

赵瑶瑶，季慧宁，马 莹，周庆瑶，葛绘春，张丽媛，2*（.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 6339；2.吉林大学 化学学院，吉林 长春 3002）



改进的QuEChERS法测定大豆中三嗪类除草剂

赵瑶瑶1，季慧宁1，马 莹1，周庆瑶1，葛绘春1，张丽媛1，2*
（1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.吉林大学 化学学院，吉林 长春 130012）

摘 要：为了得到有效的净化分离和萃取方法，对经典QuEChERS法进行改进。建立大豆中三嗪除草剂萃取、净化的新型QuEChERS法，高效液相色谱法对其进行检测。考察萃取剂类型、用量，吸附剂类型、用量，样品溶液pH值以及萃取时间等对萃取、净化效果的影响。在最有条件下，该方法线性关系良好，西玛通、草净津、敌草净、特丁通、特丁津的检出限分别是5.0，6.4，8.5，5.9和4.8μg/kg，回收率在93.1-107.8%之间，相对标准偏差低于5.6 %。

关键词：QuEChERS法；萃取；净化；三嗪除草剂；大豆；

1 三嗪类除草剂的概念

三嗪类除草剂作为选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，是早在20世纪50年代就推出的传统型除草剂，其通过光合系统（PSⅡ）以D蛋白为作用靶标，抑制植物的光合作用而发挥作用，对一年生禾本科杂草和阔叶杂草有很好的防除作用，对某些多年生杂草也有一定的抑制作用，在农业中用途十分广泛。但是由于除草剂是高度化学稳定的且用量较大，会在环境中残留很多年，因此会产生危害生物和环境的严重副作用，造成生态破坏［1-3］。大量的研究报道已经证实三嗪除草剂可能导致先天性缺陷，并可能致癌，引起内分泌失调等［4-6］。目前此类除草剂的危害越来越引起人们的关注，许多国家和地区都制定了食品中三嗪类除草剂残留最高限量规定［7-10］，欧盟（EU）立法规定了农药的最大残留限量（MRL）并确定了对人类食物中除草剂的MRL为0.01mg/ kg。

在分析复杂基质时样品的前处理是十分重要的。如液-液萃取法（LLE），索氏萃取法加压溶剂萃取法（PLE），固相萃取（SPE），基质固相分散法（MSPD），分散固相萃取（DSPE），以及快速（Quick）、简易（Easy）、廉价（Cheap）、有效（Effective）、耐用（Rugged）和安全法（Safe）的QuEChERS法［11，12］。QuEChERS法因其安全性，简单性，可调性，有效性，高效性以及结果可靠性等优点，在近几年的样品制备中应用越来越广泛。QuEChERS法是Anastassiades等人于2003年为检测水果和蔬菜中的农药而开发的方法。该方法包括用乙腈从水基质中萃取，同时使用无水MgSO4与NaCl混合，在上清液中加入MgSO4和PSA，用分散固相萃取法净化分离。高效液相色谱法（HPLC）作为监测这些极性和热稳定性除草剂的常用方法。

本实验中，乙酸乙酯和正己烷的混合物代替乙腈作为萃取大豆中三嗪除草剂的萃取剂。用少量的NaCl代替盐混合物以避免盐的凝絮。此外，将PSA的量从25mg/mL减至10mg/mL。用冷冻离心去除脂肪。此改进的QuEChERS法在处理复杂基质时能够获得快速、简便、廉价、有效和干净的除草剂萃取。

2 实验部分

2.1仪器和试剂

Agilent1200型高效液相色谱仪，配有多波长检测器、真空脱气机和Chemstation工作站（美国Agilent公司）；电子分析天平（ALC-310型，上海民桥科学仪器有限公司）；SH-36型搅拌器（正慧，上海，中国），RE-52AA型真空旋转蒸发仪（亚荣，上海，中国）；超声波清洗器（KQ2200E，中国昆山仪器有限公司）；高速离心机（Allegre 64R，美国贝克曼公司）；纯水净化仪（Milli-Q，法国Millipore公司）；移液枪（Finnpipetter F3，赛默飞世尔科技公司）；微量注射器（美国Agilent公司）；针式有机相滤膜（0.22 μm，天津兰博仪器有限公司）

西玛通、草净津、敌草净、特丁通、特丁津均购于国家药物与生物制品研究所。每种农药对照品均用甲醇配制浓度为500µg/mL的标准储备液。每周甲醇稀释标准储备液制得不同浓度的标准工作溶液。所有的溶液在4℃的冰箱中储存。

2.2样品

大豆购于当地大型超市并于4°C储存。取大豆粒，粉粹，过80目筛子，每份称取5.000g大豆粉末，分别将标准混合工作液加入到粉末样品中，为了便于均匀混合加入5mL丙酮，振荡10分钟，制得含有三嗪除草剂的加标样品。放置的加标样品也是用上述方法配得，将加标样品储存在了密封瓶中，并在4℃的条件下分别放置了7天，14天，21天和28天。

2.3HPLC条件选择

流动相A和B分别是水和乙腈，在柱温35℃的条件下梯度洗脱以达到分离目的。梯度如下：0-5min，40-60% B；5-10min， 60-80%B；15-25min， 80-40%B。流动相的流速为0.5mL•min-1。样品进样量为20μL，紫外检测波长为228 nm。

2.4QuEChERS萃取过程

准确称取5.000g样品加入到25mL离心管中，加水5mL，选择使用0.5mol•L-1NaOH和0.5mol•L-1 HCl调节样品溶液pH值到7，用力振荡20s。随后，向管中加入10mL萃取剂（乙酸乙酯：正己烷=1：1）和0.5g NaCl，超声萃取2min。样品在0℃以15000 rpm离心5min，将上清液转移至另一支含有100mg吸附剂的离心管中，搅拌混合2min，以4000rpm离心10min。然后，转移上清液至鸡心瓶中，旋转蒸干后用200µL溶剂（甲醇）回溶。得到的溶液在-10℃以15000rpm离心10min。最后，用PTFE滤膜将上清液过滤后进样分析。

2.5方法评价

2.5.1线性关系

校正曲线（工作曲线）是由加标样品中目标分析物分析后得到的峰面积和其相应的浓度绘。用上述萃取方法处理2.2中加标的样品。以峰面积A对分析物的浓度C制作工作曲线。数据的线性以线性相关系数进行评价。检出限（LOD）和定量下限（LOQ）分别是产生3倍和10倍信噪比时对应的最低浓度值。

2.5.2精密度和回收率

对于同一样品，一天内分析3次，求得日内精密度，对于同一样品，在三天内每天分析一次，求得日间精密度。日内和日间精密度以相对标准偏差（RSDs）表示。

3 结果与讨论

3.1改进萃取条件的优化

在实验条件优化过程中，所有的实验进行三次平行样测定。

3.1.1溶液pH值的影响

考察样品溶液pH值分别为2、4、6、8、10时对实验结果的影响，如图1，实验结果表明当溶液pH值从2调到6时，目标分析物的回收率逐渐增大并达到最大值；当pH值再继续增加时回收率下降，主要是因为三嗪类除草剂在弱酸环境中性质稳定，在强酸碱环境中易分解。

因此pH值选择6为最佳。

图1 溶液pH值的影响

3.1.2萃取剂的影响（类型和用量）

萃取效果的好坏直接影响着目标分析物的分析结果。为了获得最优参数，实验考察包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和乙酸乙酯/正己烷在内的五种有机单溶剂和混合溶剂的萃取效果。实验结果如图2所示，当使用乙酸乙酯/正己烷作为萃取剂时得到较高的回收率、更干净的谱图以及较低的基线噪声。

图2 萃取剂类型的影响

萃取剂体积对实验的影响也进行了考察。在2-10mL内增加萃取剂的体积，分析物峰面积的增大，但是当萃取剂体积大于10mL时，峰面积不发生变化。因此，选择萃取剂的最优体积为8mL。

3.1.3吸附剂的影响（类型和用量）

实验考察C18，PSA（N-丙基乙二胺），Al2O3，硅酸镁和硅胶在内的六种吸附剂对实验结果的影响。通过比较目标分析物的回收率发现当选择PSA时回收效果最好，这主要是因为多数的杂质都被吸附在PSA上，PSA是与NH2相似的吸附剂，有两个氨基PKa值分别为10.1和10.9。有比氨基柱更强的离子交换能力。同时PSA可与金属离子产生鳌合作用，有利于提取金属离子，能够有效去除有机酸、色素和金属离子等杂志，净化效果最佳，结果如图3。

图3 吸附剂类型的影响

PSA用量（0mg-250mg）对实验结果的影响也被考察，当PSA用量低于100mg时，目标分析物的回收率随PSA的量增加而增大；当PSA的量大于100mg时，峰面积略微降低，因此，选择PSA的量在100mg为最佳。

3.1.4萃取时间的影响

通过在1-8min内进行实验来评估萃取时间的影响。当超声萃取时间从1min到2min时，目标分析物的回收率明显增大，但当萃取时间持续延长时峰面积却基本不再变化，证明萃取过程完成。因此，选定萃取时间为2min。

3.2方法评价

3.2.1回归方程

在最优化的实验条件下，从加标样品中萃取五种三嗪除草剂并进行分析。以加标目标分析物所获得的峰面积为纵坐标，以除草剂含量为横坐标，绘制工作曲线。结果如表1，表中列出线性回归方程和相关系数。

通过工作曲线计算方法检出限（LOD）和定量限（LOQ），LOD和LOQ均由下式计算：LOD =3σ/k， LOQ =10σ/k，其中σ是将11个空白样品直接进样进行HPLC分析得到的信号的标准偏差，k是工作曲线的斜率。该方法能够取得很好的线性且全部分析物的相关系数都在0.9983到0.9999范围内，结果令人满意。

表1 分析性能Table 1 Analytical performance

3.2.2精密度和回收率

为了评价方法的精密度和准确性，制备三个加标水平（10µg/mL，50µg/mL，100µg/mL）的加标样品进行日内精密度和日间精密度的分析，日内精密度是通过1天之内平行测定3次加标样品所得到回收率的相对标准偏差。日间精密度是通过每天分析1次加标样品，连续分析3天所得回收率的相对标准偏差。结果如表2所示。

表2 样品分析结果Table 2 Analytical results of samples

2 Simeton 95.2 3.6 4.9 94.9 3.3 4.7 94.5 3.4 4.4 Cyanazine 97.8 3.4 5.0 98.8 3.1 5.1 97.2 3.5 4.7 Desmetryn 93.1 3.5 4.8 93.2 3.4 5.0 94.2 3.7 4.8 Terbumeton 104.3 3.5 5.1 105.4 3.6 4.8 105.9 4.0 4.6 Terbuthylazine 106.9 3.7 5.4 107.1 3.3 4.7 107.8 3.6 5.1 Simeton 94.8 3.8 5.3 94.4 3.4 4.8 93.7 3.1 4.4 Cyanazine 98.1 4.1 5.6 98.7 3.2 4.7 96.6 3.3 4.9 3 Desmetryn 94.2 3.9 4.8 93.7 3.5 4.6 95.4 3.3 4.7 Terbumeton 104.3 3.7 4.9 105.4 3.4 4.5 104.8 3.2 4.6 Terbuthylazine 106.8 3.6 4.8 107.2 2.9 4.2 107.2 3.4 4.8 Simeton 96.1 3.2 5.1 94.9 3.2 4.4 95.2 3.3 4.8 Cyanazine 97.4 4.0 4.9 96.7 3.1 4.9 95.7 3.3 4.9 4 Desmetryn 93.8 3.7 4.7 94.1 3.3 4.7 93.9 3.2 4.8 Terbumeton 104.9 3.4 5.1 105.4 3.4 5.1 105.1 3.0 4.2 Terbuthylazine 107.4 4.1 4.8 106.8 3.1 4.7 106.9 3.4 4.8

3.2.3样品分析

为了考察改进QuEChERS法的适用性，对加入三种标准浓度（10µg/kg、50µg•mL-1和100µg•mL-1）的大豆样品（样品1-4）进行分析。结果列于表2中。表中结果表示，现有方法能够得到很好的回收率（93.1-107.8%）和精密度（≤5.60%）。空白样和加标样的色谱图如图4所示。

图4 色谱图 （a） 标准溶液，（b） 加标样品，（c） 空白样品

4 结论

本实验为了改进QuEChERS法净化效率低的缺点，进一步得到有效的净化分离和萃取方法，成功用乙酸乙酯和正己烷的混合物萃取大豆中五种三嗪除草剂，用PSA作为吸附剂吸附样品溶液中的杂质。实验考察萃取剂、吸附剂、样品溶液pH值以及萃取时间对萃取效能和效率的影响，最后选定最优条件。

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A Modified Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe Method for the Determination of Triazine Herbicides in Soybean Sample

Zhao Yaoyao1， Ji Huining1， Ma Ying1， Zhou Qingyao1， Ge Huichun1，Zhang Liyuan1，2
（1.College of Food， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China；2.College of Chemistry， Jilin University， 130012，China）

Abstract:The classic Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe method was improved in order to get effective purification，separation and extraction method. A new type method was developed to extraction and purification of triazine herbicides from soybean sample. The high performance liquid chromatography was applied to the determination of the herbicides. The influence factors， including the effect of extraction agent， the effect of adsorbent， pH value of sample solution and extraction time， were investigated. Under the optimized experimental conditions， the linearities for determining the analytes were good. The limits of detection for simeton， cyanazine，desmetryn，terbumeton and terbuthylazine were 5.0， 6.4， 8.5， 5.9， and 4.8 μg/kg， respectively. When the present method was applied to the analysis of four soybean samples， the recoveries of the analytes ranged from 93.1% to 107.8% and relative standard deviations were lower than 5.6%.

Key words：QuEChERS method；extraction；purification；triazine herbicides；soybean；

基金项目：黑龙江省大学生创业创新训练项目，项目编号：201510223013；黑龙江省自然基金面上项目，项目编号：B2015010。

作者简介：张丽媛（1981-），女，黑龙江大庆人，硕士，讲师；研究方向：仪器分析，食品安全。