CYP2C19基因多态性对老年冠心病PCI术后抗血小板治疗的影响

梁　茜　杨希立　张健瑜　杨　光　崔金环　肖　平

(佛山市第一人民医院心血管内科,广东　佛山　528000)

CYP2C19基因多态性对老年冠心病PCI术后抗血小板治疗的影响

梁茜杨希立张健瑜杨光1崔金环1肖平1

(佛山市第一人民医院心血管内科,广东佛山528000)

〔摘要〕目的探讨中国南方汉族人中CYP2C19基因多态性与冠心病(CHD)氯吡格雷治疗后血小板活性的关系。方法选取拟行冠脉介入术治疗的中国南方汉族老年CHD患者193例，均给予氯吡格雷300 mg负荷剂量，75 mg qd维持剂量。通过流式细胞仪检测血小板聚集率，采用聚PCR RFLP法基因型进行CYP2C19基因型检测。根据不同的基因型人群间氯吡格雷的药物代谢动力学特征把携带野生型基因(*1/*1)归为快代谢型，突变杂合型(*1/*2、*1/*3)为中间代谢型、突变纯合型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)为慢代谢型。观察患者在服用氯吡格雷等药物治疗后7 d及14 d血小板聚集率的情况。结果野生型与中间代谢型、慢代谢型组间血小板聚集程度比较 差异有统计学意义(P<0.05)。中间代谢型、慢代谢型>7 d组血小板活性降低程度显著优于<7 d组，患者CYP2C19基因慢代谢型的比例为9.84%；心血管事件占8.08%，与野生型基因患者相比有差异(P<0.05)。结论CYP2C19基因突变与CHD PCI术后氯吡格雷治疗血小板活性有关。

〔关键词〕氯吡格雷；CYP2C19；基因多态性；心血管事件；血小板聚集率

冠心病(CHD)是发病率、死亡率和致残率很高的疾病之一，血小板聚集在其发生发展过程中起着重要作用。氯吡格雷已被证实能够抑制血小板功能，并且广泛应用于临床以防止缺血性事件的发生并改善疾病的后果。但目前许多研究表明在服用氯吡格雷的过程中部分患者存在氯吡格雷抵抗现象，使心血管不良事件的发生率增高，氯吡格雷反应性的个体差异很大程度取决于其活性代谢产物的形成〔1〕。CYP2C19是氯吡格雷在体内生物代谢的重要酶，经CYP450代谢转化活性代谢产物，通过抑制ADP受体依赖性的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物的形成而抑制血小板的聚集， CYP2C19基因多态性的存在与该酶活性密切相关〔2〕。本实验旨在探讨CYP2C19基因在中国南方汉族人群中的分布及其与CHD患者PCI术后氯吡格雷治疗血小板活性的关系。

1材料与方法

1.1研究对象选取2010年2月至2012年6月在我院心内科住院的CHD患者193例，均为广东佛山地区居住汉族人；经冠状动脉造影检查确诊CHD(至少一支心外膜下冠状动脉或其主要分支直径狭窄≥50%)，并行PCI术后；年龄60～72岁、相互无亲缘关系；排除肝肾疾病。

1.2氯吡格雷服用所有患者在入院前未服用过氯吡格雷药物，入院后服用氯吡格雷(商品名：波立维；杭州赛诺菲有限公司) ，服用方法为：第1天予以负荷剂量300 mg；继之75 mg，每天早上1次，至少连续服用12个月。服用氯吡格雷前、服用1 w及2 w时分别抽取静脉血检测血小板聚集率。

1.3CYP2C19基因型测定

1.3.1全血基因组DNA的提取取100 μl EDTA抗凝血，按全血DNA提取试剂盒的操作方法进行DNA提取，DNA置于-20℃冰箱备用。

1.3.2CYP2C19*2和CYP2C19*3基因片段的扩增采用PCR方法分别扩增CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的目的片段，引物的序列分别为CYP2C19*2：正义链5′-GCAGGTATAAGTCTAGGAAATG-3′，反义链5′-TAAAGTCCCGAGGGTTGTTG-3′， CYP2C19 *3正义链：5′-AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3′，反义链：5′-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3′由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应总体积25 μl，包括DNA模板2 μl，上下游引物各1 μl (10 nmol/μl)，PCR Mix 12.5 μl，去离子水8.5 μl；反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延长45 s，循环35次，72℃再延伸5 min，CYP2C19*2和CYP2C19*3目的片段长度分别为381 bp和271 bp。

1.3.3限制性内切酶反应CYP2C19*2酶切体系：总体积30 μl，其中包含10×QuickCut Green缓冲液3 μl，CYP2C19*2 PCR产物10 μl， QuickCut SamⅠ1 μl，去离子水7.3 μl，30℃保温30 min。CYP2C19*3酶切体系：总体积30 μl，其中包含10×QuickCut Green缓冲液3 μl，CYP2C19*3 PCR产物10 μl， QuickCut BamHⅠ1 μl，去离子水16 μl，30℃保温30 min。

1.3.4结果判定分别取酶切产物10 μl上样电泳，电泳条件：3.5%琼脂糖凝胶，电泳电压90 V，电流70 mA，60 min后于凝胶成像系统中拍照，以DNA分子量标准物为参考判定基因型。CYP2C19*2基因型的判定：产物为381 bp， 经限制性内切酶SamⅠ酶切后有3种基因型：野生型(G/G) 有271 bp 和110 bp 2条带，杂合型(G/A) 有381 bp、271 bp和110 bp 3条带，突变型(A/A)仅有381 bp 1条带。CYP2C19*3产物为271 bp， 经BamHⅠ酶切后有三种基因型：野生型(G/G)有175 bp、96 bp 2条带，杂合突变型(G/A)有271 bp、175 bp、96 bp 3条带，而纯合突变型仅有271 bp 1条带。因此，CYP2C19*2和CYP2C19*3型均未突变，则为CYP2C19 *1/*1型；CYP2C19*2杂合突变而CYP2C19*3未突变则为CYP2C19 *1/*2型；CYP2C19*3杂合突变而CYP2C19*2未突变则为CYP2C19 *1/*3型；CYP2C19*2纯合突变则为CYP2C19 *2/*2型；CYP2C19*2和CYP2C19*3均是杂合突变则为CYP2C19 *2/*3型；未见CYP2C19*3纯合突变(CYP2C19 *3/*3)型。

1.4试剂和仪器基因组提取试剂盒，Omega公司；ExTaq酶， dNTP来自Takara公司；PCR扩增仪，Bio-Rad公司。引物由英俊生物有限公司合成。DNA 测序由我院临床研究所协助完成。

1.5基因型分组分组观察临床心血管事件：根据不同的基因型人群间氯吡格雷的药物代谢动力学特征把携带野生型基因(*1/*1)归为快代谢型(EM)、突变杂合型(*1/*2、*1/*3)为中间代谢型(IM)、突变纯合型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)为慢代谢型(PM)。

1.6流式细胞术测定血小板聚集率所有入选病例均于服药前采集静脉血，以测定血小板聚集率并于7 d后再次抽血以测定ADP 诱导的血小板聚集率。检测方法：①标本采集：采用1∶9枸橼酸钠抗凝真空采血管，抽取静脉血2 ml，轻轻混匀后2 h内进行试验；②血小板活化：取450 μl 全血加入激活剂50 μl ADP(终浓度为20 μmol/L)轻轻混匀，室温孵育5 min；③血小板免疫荧光标记：取未加ADP及ADP 活化的全血标本5 μl ， 加入10 μl CD61-PE抗体，轻轻混匀，室温避光染色15 min后 ，加入0.5 ml 冷的(2℃～8℃) 1%多聚甲醛固定液，充分混匀，置4℃固定30 min 后，2 h内进行流式细胞术分析；④流式细胞术测定血小板聚集率：在CD61-PE vs SSC 图上设门计数血小板，以未加ADP 标本为血小板零聚集对照，ADP 活化后标本以单个血小板数量的减少反映血小板聚集率的大小。FACSCalibur，美国Becton-Dickinson公司产品。

1.7随访记录患者治疗18个月内各种心脑血管事件(包括心源性死亡、再发心肌梗死、支架内血栓形成、靶病变血管的再次重建、脑卒中)和出血事件的发生情况。

1.8统计学方法应用SPSS16.0软件进行t及χ2检验。

2结果

2.1患者CYP2C19基因型的分布入选患者中检出快代谢型(EM型)为94例，中间代谢型(IM型)为80例，慢代谢型(PM型)为19例，PM型的比例为9.84%。见表1。

2.2三组患者间的基本资料比较共入选患者193例，其中男124例，女69例，年龄60～75岁，三组患者在性别、年龄、吸烟、高血压、糖尿病等方面未见明显差异(P>0.05)。见表2。

表1　患者CYP2C19等位基因及基因型的分布

表2　患者的临床资料〔n(%)〕

2.3治疗前后CHD患者PCI不同治疗组血小板聚集率的比较氯吡格雷治疗2 w后所有组别的血小板聚集率均有明显下降(P<0.05)；EM与IM、PM组间血小板聚集程度比较差异有统计学意义(P<0.05)；IM、PM治疗2 w组血小板活性降低程度显著优于治疗1 w组。见表3。

表3　各组CHD患者血小板聚集率比较

与治疗前相比：1)P<0.05，2)P<0.01；与*1/*1组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与治疗后1 w比较：5)P<0.05，6)P<0.01

2.4随访结果所有入选患者中未发生出血事件发生，共有8例发生心血管事件，其中IM型5例(1例再发心肌梗死，1例支架内血栓形成，3例靶病变血管再次重建)，PM型3例(1例再发心肌梗死，2例靶病变血管再次重建)，在CYP2C19基因突变型患者中占8.08%，与EM患者相比有差异(P<0.05)。

3讨论

许多研究表明氯吡格雷对血小板聚集的抑制作用有显著的个体差异性。部分冠心病支架术后患者使用氯吡格雷后仍存在有血小板的高反应性，发生不良心血管事件的概率增高。Sofi等〔3〕在一项荟萃分析提出8 043名冠心病使用氯吡格雷患者随访6个月到8.3年，CYP2C19(*)2基因多态性与不良心血管事件和支架内血栓形成相关。氯吡格雷抵抗发生机制尚未完全清楚，Nguyen等〔4〕将其大致分为外部因素和内部因素， 外部因素包括某些患者依从性差，氯吡格雷的生物利用度低， 使用剂量不足， 药物间相互作用使CYP450 对氯吡格雷的代谢效率降低等，而内部因素包括基因的多态性、血小板激活途径的变异导致血小板高反应性等。氯吡格雷体内代谢环节酶类基因多态性导致的功能异常在氯吡格雷抵抗中起主要作用，CYP2C19的基因多态性是近年研究的热点之一。

在中国汉族人群中，CYP2C19基 因 突 变 的 类 型主要是CYP2C19*2和CYP2C19*3。与亚洲人群的结果相符〔5〕。本研究的患者均为南方汉族人，CYP2C19野生型基因患者仅有48.45%，大部分患者携带*2或者*3等位基因，此比例高于欧洲的研究，提示我国南方地区汉族人CYP2C19基因可能有更高的比例发生突变，这有待日后扩大样本量进一步研究。

Yamamoto等〔6〕研究提示双联抗血小板治疗 (氯吡格雷+阿司匹林)残余血小板活性弱于单用阿司匹林组，双联组、野生型CYP2C19纯合子的血小板活性显著降低，之后为杂合子*1*2和*1*3，而*2*3、*2*2及*3*3纯合子抑制不充分。然而当双联疗法再分为两组，<7 d组及>7 d组，>7 d组血小板活性降低显著优于<7 d组，而且突变型心血管事件发生率高于野生型纯合子。即使是双联疗法，不同临床因素及基因多态性，可持续影响血小板的高反应性。

本研究治疗后血小板活性降低程度野生型>杂合子>突变纯合子， >7 d组杂合子血小板活性降低程度显著优于<7 d组，与Yamamoto等〔6〕报道相符， 提示延长抗血小板时间可能进一步改善血小板聚集程度。

本研究随访18个月，再发心肌梗死、支架内血栓形成、靶病变血管的再次重建事件均发生在携带*2或者*3等位基因的患者，快代谢基因型患者中无一例发生心脑血管事件，这与国外研究一致，提示在中国南方汉族人中CYP2C19基因多态性与主要不良心血管事件相关，并可能用血小板聚集程度差异来解释，但由于病例数及心血管事件数少，事件发生时未检测血小板聚集程度，有待增加样本量进一步研究。在支架植入术后合并氯吡格雷低反应性临床表现的患者群(如高龄、反复支架血栓、超重以及糖尿病等)可能需要检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因。

4参考文献

1Sawada T，Shinke T，Shite J，etal. Impact of cytochrome P450 2C19*2 polymorphism on intra-stent thrombus after drug-eluting stent implantation in Japanese patients receiving clopidogrel〔J〕. Circ J， 2011;75(1)：99-105.

2Fefer P， Matetzky Spaul. The genetic basis of platelet responsiveness to clopidogrel. A critical review of the literature〔J〕. Thromb Haemost， 2011;106(2)：203-10.

3Sofi F， Giusti B， Marcucci R，etal.Cytochrome P450 2C19(*)2 polymorphism and cardiovascular recurrences in patients taking clopidogrel：a meta-analysis〔J〕. Pharmacogenomics J,2011;11(3):199-206.

4Nguyen TA， Diodati JG， Pharand C. Resistance to clopidogrel：a review of the evidence〔J〕.J Am Coll Cardiol，2005;45(8)：1157-64.

5Hwang SJ， Jeong YH， Kim IS，etal.The cytochrome 2C19*2 and *3 alleles attenuate response to clopidogrel similarly in East Asian patients undergoing elective percutaneous coronary intervention〔J〕. Thromb Res， 2011;127(1)：23-8.

6Yamamoto K ，Hokimoto S， Chitose T，etal. Impact of CYP2C19 polymorphism on residual platelet reactivity in patients with coronary heart disease during antiplatelet therapy〔J〕. J Cardiol,2011;57：194-201.

〔2014-12-31修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：2010年佛山市科技发展资金项目(201008091)

通讯作者：杨希立(1963-)，男，硕士，主任医师，主要从事冠心病临床研究。

〔中图分类号〕R541.4；R446.11

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2664-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.043

1佛山市第一人民医院临床研究所

第一作者：梁茜(1966-)，女，硕士，主任医师，主要从事冠心病临床研究。