新型蛋白酶体抑制剂MLN2238对胃癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

郭　锰　万里新　张成辉　徐　赟

(南阳市中心医院肿瘤内科，河南　南阳　473000)

新型蛋白酶体抑制剂MLN2238对胃癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

郭锰万里新张成辉徐赟

(南阳市中心医院肿瘤内科，河南南阳473000)

〔摘要〕目的探讨新型蛋白酶体抑制剂MLN2238对胃癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法取对数生长期胃癌细胞系 BGC-823和SGC-7901，按照MLN2238终浓度0、25、50、75、100 nmol/L分为5组，处理24、48、72 h后采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测各孔吸光值并计算存活率以评价MLN2238对胃癌细胞的增殖抑制作用；处理48 h后经膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双标或PI标记后，采用流式细胞术检测胃癌细胞凋亡率及细胞周期的变化。结果相同作用时间(24、48或72 h)下，随着MLN2238浓度的增加，MLN2238处理后BGC-823、SGC-7901细胞的存活率降低(P<0.05)；相同MLN2238浓度(25、50、75或100 nmol/L)情况下，除100 nmol/L MLN2238作用24 h和48 h的BGC-823细胞存活率间无统计学差异外(P>0.05)，随MLN2238作用时间的延长，MLN2238对BGC-823、SGC-7901细胞的增殖抑制作用也基本呈递增趋势(P<0.05)；MLN2238处理BGC-823、SGC-7901细胞48 h后，除75、100 nmol/L MLN2238作用BGC-823细胞各周期细胞比例的差异无统计学意义外(P>0.05)，随MLN2238浓度的增加，BGC-823、SGC-7901细胞的凋亡率、G0/G1期细胞比例均升高，S、G2/M期细胞比例降低，且MLN2238的促凋亡效应和促细胞周期G0/G1期阻滞作用呈浓度依赖性(P<0.05)。结论MLN2238可抑制胃癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡及G0/G1期阻滞，MLN2238的以上作用与作用时间和作用浓度有关。

〔关键词〕MLN2238；胃癌细胞；增殖；凋亡；细胞周期

目前蛋白酶体已成为一个有效的抗癌治疗靶点〔1，2〕。MLN2238是一种口服活性蛋白酶体抑制剂，为第二代蛋白酶体抑制剂〔3〕。有研究表明，MLN2238有较为广谱的强抗肿瘤作用，不仅在体外可抑制肿瘤细胞株，而且在前列腺癌裸鼠移植瘤上亦有较好的抗癌效果〔4〕。目前MLN2238对胃癌细胞是否有抑制作用尚不清楚，本研究旨在探讨MLN2238对胃癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂胃癌细胞系 BGC-823、SGC-7901购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，新型蛋白酶体抑制剂MLN2238购自美国Selleck公司，青霉素、链霉素购于北京索莱宝科技有限公司，胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Hyclone公司，RPMI-1640培养基购自美国Gibco BRL公司，二甲亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)及碘化丙锭(PI)购自美国Sigma公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/PI凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。

1.2细胞培养常规方法复苏于液氮中保存的BGC-823、SGC-7901细胞，培养于含10%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml 链霉素的RPMI-1640培养液中，将CO2细胞培养箱的温度设置为37℃、CO2体积分数设置为5%，每2～3天换液一次，待培养至对数生长期时，收集细胞进行实验。

1.3MTT法检测细胞增殖情况采用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期BGC-823、SGC-7901细胞后加入新鲜RPMI-1640培养基配制单细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔板中，每孔体积200 μl，常规条件培养24 h后按照MLN2238终浓度0、25、50、75、100 nmol/L分为5组，每组设 3个复孔，处理24、48、72 h后向每孔加入MTT溶液，避光反应4 h后，采用150 μl DMSO溶液替换MTT溶液，在490 nm波长下检测各孔吸光值(A490)并计算存活率以评价MLN2238对胃癌细胞的增殖抑制作用。存活率(%)=(加药组A490/对照组A490)×100%。实验重复3次。

1.4细胞凋亡率及细胞周期检测将密度为3×106/ml的细胞悬液接种于6孔板中，按照MLN2238终浓度0、25、50、75、100 nmol/L分为5组，每组设 3个复孔，常规培养48 h后收集细胞并等分为两部分：(1)经磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗及Binding Buffer悬浮后，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光反应15 min后上流式细胞仪测定检测细胞凋亡率；(2)加入PI上流式细胞仪测定检测细胞周期。以上操作均严格依据凋亡检测试剂盒说明书。实验重复3次。

1.5统计学处理采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2结果

2.1MLN2238处理对胃癌细胞增殖的影响相同作用时间(24、48或72 h)下，随着MLN2238浓度的增加，MLN2238处理后BGC-823、SGC-7901细胞的存活率降低(P<0.05)；相同MLN2238浓度(25、50、75或100 nmol/L)情况下，除100 nmol/L MLN2238作用24 h和48 h的BGC-823细胞存活率间无统计学差异外(P>0.05)，随MLN2238作用时间的延长，MLN2238对BGC-823、SGC-7901细胞的增殖抑制作用也基本呈递增趋势(P<0.05)。见表1。

2.2MLN2238处理对胃癌细胞凋亡的影响MLN2238处理BGC-823、SGC-7901细胞48 h后，随着MLN2238浓度的增加，BGC-823、SGC-7901细胞的凋亡率均升高，且MLN2238的促凋亡效应呈浓度依赖性(P<0.05)。见表2。

2.3MLN2238处理对胃癌细胞周期的影响MLN2238处理BGC-823、SGC-7901细胞48 h后，除75、100 nmol/L MLN2238作用BGC-823细胞各周期细胞比例的差异无统计学意义外(P>0.05)，随MLN2238作用浓度的升高，BGC-823、MLN2238作用后的G0/G1期细胞比例升高，S、G2/M期细胞比例降低，MLN2238对BGC-823、SGC-7901细胞周期G0/G1阻滞作用基本上呈递增趋势(P<0.05)。见表3。

表1　MLN2238处理后BGC-823、SGC-7901细胞的存活率变化

与0 nmol/L比较：1)P<0.05；与25 nmol/L比较：2)P<0.05；与50 nmol/L比较：3)P<0.05；与75 nmol/L比较：4)P<0.05；下表同

表2　不同浓度MLN2238处理胃癌细胞48 h后的凋亡率

表3　MLN2238处理BGC-823、SGC-7901细胞48 h后细胞周期分布情况

3讨论

蛋白酶体抑制剂硼替佐米和卡非佐米在临床试验的成功运用，表明蛋白酶体抑制剂在抗肿瘤治疗中的重要作用〔5〕。此外，包括Marizomib(又名NPI-0052)、雷公藤红素和EGCG等天然产物在内的多种蛋白酶体抑制剂已进行了临床或临床前阶段〔6〕。MLN2238目前已进入了临床I期试验，研究表明MLN2238具有较强的抗肿瘤效果，可增强第一代蛋白酶体抑制剂或其他化疗药物的抗肿瘤效果〔3，4〕，同时对利妥昔单抗化疗耐药的B细胞淋巴瘤也有较好的杀灭效果〔7〕。本研究发现MLN2238可抑制胃癌BGC-823、SGC-7901细胞的增殖，且该抑制作用呈浓度和时间依赖性，与Wei等〔4〕在前列腺癌细胞中报道的结果一致，表明抑制蛋白酶体活性可能成为多种恶性肿瘤的治疗策略。

蛋白酶体底物在细胞凋亡和细胞周期进程中起重要作用，而阻断蛋白酶体活性可导致蛋白酶体底物的积累，继而影响细胞凋亡和细胞周期进程〔8，9〕。本研究发现MLN2238可升高胃癌BGC-823、SGC-7901细胞的凋亡率，通过直接证据表明MLN2238可诱导胃癌细胞凋亡。有研究表明MLN2238可调控促凋亡蛋白p53 或NOXA的表达，继而诱导多种恶性肿瘤的凋亡〔7〕。因此本研究推测MLN2238可能也通过诱导p53 或NOXA表达来促进胃癌细胞的凋亡。此外，细胞周期调控紊乱是胃癌恶性的主要表现之一〔10，11〕。本研究进一步表明MLN2238可抑制胃癌细胞周期的进程，将细胞阻滞在G0/G1期。但目前MLN2238影响胃癌细胞周期的机制尚不清楚，推测可能与调控G1向S期转化的细胞周期蛋白表达有关。

4参考文献

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〔2015-08-10修回〕

(编辑滕欣航)

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2621-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.024

第一作者：郭锰(1981-)，男，副主任医师，硕士，主要从事恶性肿瘤的介入治疗研究。