甘草次酸对哮喘大鼠肺泡灌洗液白细胞计数及血清相关炎症因子的影响

林香花　冯可青　郑素歌　钱皓瑜　陈卓昌

(河南省人民医院呼吸科，河南　郑州　450000)

甘草次酸对哮喘大鼠肺泡灌洗液白细胞计数及血清相关炎症因子的影响

林香花冯可青郑素歌钱皓瑜陈卓昌

(河南省人民医院呼吸科，河南郑州450000)

〔摘要〕目的探讨甘草次酸对哮喘大鼠肺泡灌洗液(BALF)白细胞计数及血清相关炎症因子的影响。方法选择健康清洁级雄性SD大鼠30只，随机分为哮喘模型组、甘草次酸组及正常对照组各10只。通过向哮喘模型组、甘草次酸组大鼠腹腔注射鸡卵清蛋白(OVA)+氢氧化铝凝胶致敏，并采用OVA雾化吸入激发形成哮喘模型。每次激发前2 h给予甘草次酸组大鼠10 mg/100 mg甘草次酸灌胃，哮喘模型组与正常对照组给予0.9%生理盐水0.1 ml/100 mg灌胃。最后一次激发完成后24 h内采集血清，采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定三组血清免疫球蛋白(Ig)E、白细胞介素(IL)-13、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平，收集三组BALF对细胞沉渣进行瑞氏染色，并按照白细胞种类进行计数。结果根据临床症状及病理检查结果判定哮喘模型组、甘草次酸组造模成功；甘草次酸组较哮喘模型组中性粒细胞表达相对上升，但较正常对照组明显上升，而淋巴细胞及嗜酸性粒细胞表达较哮喘模型组相对降低，但较正常对照组明显上升(均P<0.05)；哮喘模型组血清IgE、IL-13、TNF-α表达水平最高，甘草次酸组居中，正常对照组最低(P<0.05)，而正常对照组IL-18表达水平最高，其次是甘草次酸组，哮喘模型组最低(P<0.05)。结论甘草次酸通过选择性诱导成熟T淋巴细胞凋亡，减少嗜酸性粒细胞的产生，抑制IgE、IL-13、TNF-α炎症因子表达，有效减轻哮喘大鼠气道炎症的产生，发挥平喘功效。

〔关键词〕甘草次酸；哮喘模型；免疫球蛋白E；白细胞

研究发现，白细胞介素(IL)-18和肿瘤坏死因子(TNF)-α介导下出现T细胞亚群功能失调，并引起IgE等炎症因子异常是导致哮喘发生的重要原因〔1〕。近年来，甘草治疗哮喘的疗效研究不断深入〔2〕，其中甘草次酸分子结构相似于甾体激素，具有抗感染、抗溃疡、抗病毒等功效。本研究旨在探讨甘草次酸治疗哮喘的临床疗效及其机制。

1材料和方法

1.1试验动物选择由郑州大学医学院提供的8周龄健康清洁级雄性SD大鼠30只，体重150～200 g，合格证号：2012-0014。 普通饮食喂养，全自动供水，喂养室温控制在(22±2)℃，湿度控制在50%～70%，适度光照，通风及洁净程度良好。

1.2主要药品与试剂纯度≥98%的甘草次酸(西安天行健天然生物制品集团公司生产)；氢氧化铝凝胶(美国Sigma公司生产)；鸡卵清蛋白(OVA，美国sigma公司生产)；大鼠免疫球蛋白(Ig)E、IL-13、IL-18 及TNF-α酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司生产)。

1.3主要试验仪器美国BioTek公司生产的EXL800型酶标仪；美国Biofiige stratos公司生产的Sorvall低温离心机；南京道芬中美合资有限公司生产的S-888E型超声雾化机；中国科技大学实业总公司生产的R-911型全自动放免计数仪。

1.4造模方法〔3〕将30只SD大鼠随机分为哮喘模型组、甘草次酸组及正常对照组各10只。哮喘模型组与甘草次酸组大鼠均在试验第1天及第8天腹腔注射OVA 1 mg+氢氧化铝凝胶100 mg混悬液1 ml致敏，正常对照组同一时点给予等量0.9%生理盐水进行腹腔注射。第9天开始，每天将哮喘模型组与甘草次酸组大鼠放入有雾化器的有机玻璃盒中，分别给予1 mg/ml OVA雾化吸入30 min激发致敏，连续7 d，参考哮喘模型成功评价标准〔4〕，评判哮喘模型造模结局。正常对照组使用0.9%生理盐水代替进行雾化吸入30 min/d。每次激发前2 h给予甘草次酸组大鼠10 mg/100 mg甘草次酸灌胃，哮喘模型组与正常对照组给予0.9%生理盐水0.1 ml/100 mg灌胃。

1.5指标检测最后一次激发完成后24 h，麻醉大鼠并采集腹主动脉血液，2 000 r/min离心10 min，取上层血清，采用ELISA法测定血清IgE、IL-13、IL-18、TNF-α水平。采集完毕后处死大鼠，在颈部正中区域分离气管并插入留置针，使用1 ml生理盐水反复灌洗，每次灌洗后即刻进行回吸，收集肺泡灌洗液(BALF)，共进行8次，之后对BALF 1 000 r/min离心10 min，对细胞沉渣进行瑞氏染色并按照白细胞种类进行计数。

1.6统计学方法应用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD检验。

2结果

2.1哮喘模型造模结果造模完成后，与正常对照组比较，哮喘模型组、甘草次酸组的大鼠呼吸频率显著增加(均>20%)，所有大鼠经过哮喘激发30 min左右均出现不同程度的烦躁不安、腹肌抽搐、大小便失禁、毛发竖起、活动减少、饮食减少、口鼻发绀等症状。后期病理切片检测两组大鼠支气管壁周围均出现大量的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润，并出现支气管气道上皮细胞脱落，杯状细胞增多等现象；同时，两组大鼠BALF中IgE水平明显上升，沉渣嗜酸性粒细胞计数(EOS)增多。判定哮喘模型组、甘草次酸组造模成功。

2.2三组SD大鼠BALF白细胞分类计数比较三组SD大鼠BALF中淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞含量差异显著(P<0.05)，其中哮喘模型组大鼠淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞含量最高；甘草次酸组较哮喘模型组相对降低，但较正常对照组仍然较高(P<0.05)。见表1。

表1三组SD大鼠BALF白细胞分类计数比较

组别淋巴细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞甘草次酸组31.15±3.201)2)60.75±3.051)2)7.35±0.801)2)哮喘模型组55.20±6.251)72.30±5.051)12.30±4.151)正常对照组22.50±2.1548.15±4.203.30±0.55F值18.2525.1712.19P值0.010.010.01

与正常对照组比较：1)P<0.05；与哮喘模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.3三组IgE、IL-3、IL-18、TNF-α表达水平比较三组IgE、IL-13、IL-18、TNF-α水平差异显著(P<0.05)，其中哮喘模型组IgE、IL-13、TNF-α表达水平最高，甘草次酸组居中，正常对照组最低(P<0.05)，而正常对照组IL-18表达水平最高，其次是甘草次酸组，哮喘模型组最低(P<0.05)。见表2。

表2　三组IgE、IL-13、IL-18、TNF-α

3讨论

研究发现免疫系统T细胞亚群功能失调以及IL、TNF-α等炎症因子表达水平异常是引发患者哮喘的重要因素〔5〕。辅助性T细胞(Th)是重要的T细胞亚群，根据其分泌的细胞因子的不同可分为Th0、Th1、Th2 和Th3 4个亚型。其中Th1细胞主要分泌IL-2、干扰素(IFN)-γ、IFN-α、TNF-α等；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，主要功能为刺激B细胞增殖并产生IgG和IgE抗体，与体液免疫有关〔6〕。机体正常情况下，Th1和Th2细胞处于相对平衡状态，共同维护机体正常的细胞及体液免疫，当受到外界刺激时，Th1和Th2细胞出现极化偏向，引起Th1/Th2比例失调，Th2细胞的增加促进了B细胞产生大量IgE和分泌炎症性细胞因子，进一步刺激上皮细胞、内皮细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性细胞等产生白三烯、内皮素、前列腺素和血栓素A2等多种炎症介素，随着上述介质含量的上升可以引发支气管平滑肌挛缩，毛细血管扩张，腺体分泌增多，形成Th1型和Th2型相关变态反应，同时促使神经源性炎症的产生〔7〕。同时，B细胞产生的大量IgE能与肥大细胞、上皮细胞表面的受体结合，引起上述细胞进一步释放炎性介质，导致气道高反应性、黏液分泌增强并导致静脉通透性增高〔8〕。血管通透性增加以及气道黏膜水肿的产生，从另一方面导致哮喘发作〔9〕。另外，研究发现〔10〕炎症因子IL-13可通过上调神经生长因子mRNA的表达对哮喘发病时异常的免疫过程进行正向调节，而IL-18作为机体抵抗严重感染所必需的重要细胞因子，通过促进Th0细胞分化为Th1细胞，产生IFN-γ、TNF-α、粒-巨噬细胞集落刺激因子，并下调神经生长因子mRNA的表达，可发挥负向调节哮喘免疫应答的作用。

甘草次酸是从甘草中提取的生物活性物质，属于五环三萜类化合物。本研究提示免疫系统功能失调与血清炎症因子对哮喘的发生发展具有重要作用。而且甘草次酸可通过抑制炎症反应及调节免疫功能来改善大鼠的哮喘症状。分析原因可能为：(1)甘草次酸具有类似甾体激素的分子结构，通过抑制甾体激素代谢失活酶，进一步提高内源性和外源性糖皮质激素的活性，同时通过竞争糖皮质激素受体，发挥部分激动拮抗剂特性〔10〕；(2)甘草次酸具有选择性诱导成熟T淋巴细胞凋亡的功能，在一定程度上对外周血T淋巴细胞亚群失衡进行了纠正，并通过抑制IgG、IgE抗体的生成，多靶点对补体系统进行抑制，进而发挥对炎性细胞因子和炎症介质生成进行抑制的作用〔11〕。总之，甘草次酸通过选择性诱导成熟T淋巴细胞凋亡，减少嗜酸性粒细胞的产生，抑制IgE、IL-13、TNF-α炎症因子表达，有效减轻哮喘大鼠气道炎症的产生，发挥平喘功效，对临床应用具有参考价值。

4参考文献

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11朱晓洁，王珺，张予阳.多机制多通路参与哮喘新说〔J〕.沈阳药科大学学报，2014；31(4)：325-30.

〔2015-07-12修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：陈卓昌(1965-)，男，博士，主任医师，主要从事支气管哮喘方面的研究。

〔中图分类号〕R56

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2613-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.020

第一作者：林香花(1979-)，女，博士，主治医师，主要从事支气管哮喘方面的研究。