外源性IL-8上调其受体表达促进宫颈癌Hela细胞增殖

李凤英　杨　杨　李鑫屹　李　玥　黄校青　朱秀琳　杨　哲　刘星吾　张　琪　许珊珊　李　宇洛桑曲珍　徐金铭　王伟群　贾琳琳

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江　佳木斯　154007)

外源性IL-8上调其受体表达促进宫颈癌Hela细胞增殖

李凤英1杨杨李鑫屹李玥黄校青朱秀琳杨哲刘星吾张琪许珊珊李宇洛桑曲珍徐金铭王伟群贾琳琳

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

〔摘要〕目的研究白细胞介素(IL)-8及其受体(R)A和B mRNA在Hela宫颈癌细胞株的表达及外源性IL-8对Hela细胞增殖的作用。方法实时聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测IL-8及IL-8RA和IL-8RB 在Hela细胞的表达；MTT法检测不同浓度的外源性IL-8对Hela细胞增殖的影响；RT-PCR方法检测外源性IL-8对IL-8RA和IL-8RB表达的影响。结果Hela细胞表达IL-8及IL-8RA和IL-8RB，并且IL-8RA的表达量明显高于IL-8RB；外源性IL-8可显著促进Hela细胞的增殖，并明显上调IL-8RA和IL-8RB的表达。结论外源性IL-8可通过上调Hela细胞IL-8RA 和 IL-8RB的表达而促进其增殖。

〔关键词〕宫颈癌；白细胞介素(IL)-8；IL-8RA；IL-8RB

宫颈癌发病率已居女性生殖系统恶性肿瘤的第一位，并位于女性所有恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二位〔1〕。宫颈癌的发病率有明显的地区和国籍差别，据统计，中国女性中宫颈癌发病率最高，已位列世界第一位。目前认为宫颈癌的发病与炎症、早婚、早育及多产等因素有关。白细胞介素(ILs)是由多种细胞产生的、具有多种生物学效应的一类细胞因子，在免疫细胞的成熟、活化、增殖及免疫应答等方面发挥重要作用。ILs可通过多种信号转导通路参与肿瘤的增殖、存活、凋亡、转移、血管发生等多种生物学行为〔2～7〕。本研究探讨IL-8及其受体(R)A和B在Hela宫颈癌细胞株的表达及IL-8对Hela细胞增殖的作用。

1材料与方法

1.1实验用细胞、试剂及仪器Hela细胞(中科院上海细胞库)；RPMI1640培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)；青链霉素(碧云天生物技术公司)；胰蛋白酶(武汉博士德生物工程有限公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；cDNA第一链合成试剂盒，PCR mix，D2000(北京天根生化科技有限公司)；重组人IL-8(美国PeproTech公司)；CCK8试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；二氧化碳培养箱(北京金西盟仪器有限公司)；超级洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；光学倒置显微镜(日本奥林巴斯光学有限公司)；PCR仪(德国Biometra Tprofessional公司)；电子精密天平(上海精天电子仪器有限公司)。

1.2RT-PCR检测IL-8 及其受体mRNA在Hela细胞的表达用Trizol试剂常规提取细胞总RNA，分光光度计测定OD值并计算RNA浓度。RNA浓度计算公式为：μg/μl= 40×OD260×稀释倍数/1 000。将模板RNA按下列操作逆转录成cDNA：向无核酸酶的离心管中加入以下反应物：2 μg总RNA，2 μl Oligo(dT)15，2 μl Super Pure dNTP；最后加入RNase-Free ddH2O，使总体积定容至14.5 μl；70℃加热5 min并迅速置于冰浴冷却2 min；短暂离心后加入4 μl 5×First-Strand缓冲液和0.5 μl Rnasin；加入1 μl TIANScript M-MLV，轻轻混匀；42℃水浴50 min；95℃加热50 min以终止反应；将冻存管置于-80℃冻存备用。查阅Genebank登陆的β-actin、IL-8、IL-8RA和IL-8RB的mRNA序列，依照PCR引物设计原则，用Primer 5软件基因的正向和反向引物。引物序列如下，β-actin：正向引物，5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′，反向引物，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3′。IL-8：正向引物，5′ACATACTCCAAACCTTTCCACC-3′，反向引物，5′-AAAACTTCTCCACAACCCTCTG-3′。IL-8RA：正向引物，5′-GACCTACTCTTTGCCCTGAC-3′，反向引物，5′-AACACCATCCGCCATTTT-3′。IL-8RB：正向引物，5′-GGAAACTCCCTCGTGATG-3，反向引物，5′-CAGGAATGTGCCAAAAAT-3′。各基因PCR反应条件见表1。将6 μl各基因产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察、拍摄及分析结果。

表1　PCR反应条件

1.3生长实验将Hela细胞重悬于含10%FBS 和100 U/ml青链霉素的1640完全培养基并接种于96孔板中，细胞悬液量和细胞数分别为100 μl/孔和1.5×103个/孔；孔板置于含5%CO2的37℃培养箱中培养24 h；待细胞完全贴壁后，将孔板中细胞随机分成5组，每组7孔，分别为对照组和实验组1、2、3和4，并更换新鲜条件培养基〔对照组新鲜条件培养基为1640完全培养基+0.1%牛血清白蛋白(BSA)；实验组新鲜条件培养基为1640完全培养基+溶于0.1% BSA的外源性重组人IL-8，以保证实验组1、2、3和4的IL-8终浓度分别为10、20、40、60和80 ng/ml〕；自更换培养基起，继续培养细胞48 h，用CCK8检测细胞增殖情况。

1.4统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行q检验。

2结果

2.1Hela细胞表达IL-8 及其受体IL-8RA和IL-8RB mRNAIL-8 及IL-8RA和IL-8RB mRNA在Hela细胞中均有表达，见图1。IL-8RA与IL-8RB mRNA的相对表达量分别为(4 264.67±505.80)和(1 644.33±320.72)，两者差异显著(P<0.01)。

图1　IL-8 及IL-8RA和IL-8RB mRNA在Hela细胞中的表达

2.2外源性IL-8促进Hela细胞的增殖 MTT结果IL-8终浓度为0、20、40、60和80 ng/ml的吸光度值分别为(1.08±0.12)、(1.12±0.14)、(1.28±0.04)、(1.34±0.06)和(1.27±0.06)，该数值可表示细胞的增殖情况。与0 ng/ml IL-8比较，当IL-8终浓度为40、60和80 ng/ml时可显著促进Hela细胞的增殖(P<0.05，P<0.01)；终浓度从20 ng/ml到60 ng/ml的促Hela细胞增殖效应具有剂量依赖性；终浓度增至80 ng/ml时，增殖率有所降低，但与60 ng/ml比较，40和80 ng/ml的增殖率无显著性差异。

2.3外源性IL-8上调IL-8RA和IL-8RB的表达IL-8终浓度为0、60和80 ng/ml组的IL-8RA相对表达量分别为(0.70±0.04)、(0.88±0.05)和(1.58±0.09)，而IL-8RB相对表达量分别为(0.54±0.04)、(0.84±0.03)和(0.78±0.05)。外源性IL-8可上调其受体L-8RA和IL-8RB的表达。见图2。

图2　外源性的IL-8上调IL-8RA和IL-8RB的表达

3讨论

IL-8 是具有诱导细胞做定向移动的细胞因子，属于 CXC(C为半胱氨酸，X为任意氨基酸)类趋化因子家族成员，故又名CXCL8。研究表明〔8，9〕，IL-8 可通过MAPK/ERK和 PI3K/Akt 信号转导途径经自分泌和旁分泌机制参与肿瘤细胞增殖。Milliken等〔10〕报道高表达CXCL8的卵巢癌上皮细胞株的增殖速度明显快于低表达CXCL8的细胞株。Inoue等〔11〕的研究表明高转移性前列腺癌细胞株PC-3M-LN4的IL-8表达量明显高于低转移性前列腺癌细胞株PC-3P。将PC-3P和PC-3M-LN4细胞分别转染全长有意义IL-8序列和全长反义IL-8序列，体外实验显示，PC-3P细胞过表达IL-8可上调基质金属蛋白酶(MMP)-9和胶原蛋白酶活性，并且其通过基质胶的能力明显增强，而转染反义IL-8序列的PC-3M-LN4细胞的IL-8和MMP-9表达量、胶原蛋白酶活性及细胞通过基质胶的能力都较对照组有所降低。在PC-3P细胞过表达IL-8可明显促进其在裸鼠体内的致瘤性、转移和血管发生。

本研究结果与上述肿瘤中的研究结果相一致〔8～11〕，即外源性IL-8可促明显进Hela细胞的增殖，并表现为剂量依赖性，当IL-8浓度大于40 ng/ml时，其促进增殖效应具有统计学意义。但是，当IL-8的浓度升至80 ng/ml时，其增殖效率较40 ng/ml和60 ng/ml的IL-8有所降低。以往的实验也表明〔12〕，同为CXC类趋化因子的CXCL5，当其浓度增加至一定范围时，也具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。目前仍然不清楚造成此结果的原因，推测IL-8可能对MAPK/ERK和PI3K/Akt信号具有双向调节作用，即超高浓度的IL-8可抑制MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路，从而使其促进增殖作用有所减弱。IL-8的肿瘤促进作用是通过其受体介导的。本文结果表明，IL-8对其两种受体均具有正向调节作用。在肺癌中，癌组织高表达的IL-8RA和IL-8RB可使癌细胞对IL-8的反应性增强，从而最大限度地发挥IL-8的促癌作用〔13〕。由此推断IL-8促Hela细胞增殖作用部分地是通过上调IL-8RA和IL-8RB而发挥的。在今后利用转染等手段继续通过自分泌和旁分泌在体外和体内实验开展IL-8在宫颈癌中的作用，以期更深入探讨IL-8的作用机制，为临床诊断和治疗宫颈癌提供新的检测指标和治疗靶点。

4参考文献

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11Inoue K，Slaton JW，Eve BY，etal.Interleukin-8 expression regulates tumorigenicity and metastases in androgen-independent prostate cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2000；6(5)：2104-19.

12Begley LA，Kasina S，Mehra R，etal.CXCL5 promotes prostate cancer progression〔J〕.Neoplasia，2008；10(3)：244-54.

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〔2014-11-25修回〕

(编辑苑云杰)

Exogenous IL-8 up-regulates the expression of its receptor and promotes proliferation of uterine cervix cancer Hela cell

LI Feng-Ying, YANG Yang, LI Xin-Yi,et al.

The Basic Medical College of Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate mRNA expressions of IL-8 and its receptors IL-8RA and IL-8RB in Hela uterine cervix cancer cell line and the effect of exogenous IL-8 on the proliferation of Hela cell.MethodsThe expressions of IL-8 and IL-8RA and IL-8RB were detected by RT-PCR assay; the influence of different concentrations of exogenous IL-8 on proliferation of Hela cell was detected by MTT assay; the effects of exogenous IL-8 on the expressions of IL-8RA and IL-8RB were detected by RT-PCR assay.ResultsIL-8 and IL-8RA and IL-8RB were expressed in Hela uterine cervix cancer cell line, and the expression level of IL-8RA was significantly more than that of IL-8RB; exogenous IL-8 significantly promoted proliferation of Hela cell and up-regulated the expression of IL-8RA and IL-8RB.ConclusionsExogenous IL-8 could up-regulate the expressions of IL-8RA and IL-8RB and ultimately promote proliferation of Hela cell.

【Key words】Uterine cervix cancer; IL-8；IL-8RA; IL-8RB

基金项目：国家自然科学基金面上项目(No.81272854)；黑龙江省自然科学基金项目(No.D201129)；黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(No.201410222036)；佳木斯大学科研项目(No.Sz2009-008)；佳木斯大学生科技创新面上项目(No.XSYM2014-008)

通讯作者：王伟群(1974-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事肿瘤病理生理学研究。

〔中图分类号〕R737.33

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2603-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.015

1佳木斯市妇幼保健院妇产科

贾琳琳(1975-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事听觉生理研究。

第一作者：李凤英(1974-)，女，副主任医师，主要从事女性生殖系统病理生理学研究。