益气养阴通络法对兔腹主动脉内膜剥脱术后内皮功能的影响*

王奎英　刘彤　杨莺△（1.辽宁中医药大学，辽宁　沈阳　11002；2.辽宁省沈阳市中医院，辽宁　沈阳　11004；.辽宁中医药大学附属医院，辽宁　沈阳　11002）



益气养阴通络法对兔腹主动脉内膜剥脱术后内皮功能的影响*

王奎英1，2刘彤3杨莺3△
（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳110032；2.辽宁省沈阳市中医院，辽宁沈阳110034；3.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032）

【摘要】目的探讨具有益气养阴通络功效的通脉颗粒防治经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后再狭窄的可行性。方法将48只新西兰大耳兔按照随机数字表法分为正常组、模型组、通脉颗粒组（中药组）、阿托伐他汀组（西药组），各12只。正常组未经手术及用药，模型组、中药组、西药组用球囊导管剥脱兔腹主动脉内膜行手术造模。模型组术前及术后未用药；中药组于术前1 d开始给予通脉颗粒灌胃给药，连续用药3周；西药组于术前1 d开始给予阿托伐他汀口服，连续用药3周。3周后采血检测内皮素（ET-1），一氧化氮（NO）；Western方法检测兔腹主动脉血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子（TGF）-β1蛋白表达。结果中药组和西药组可明显增加血浆NO，降低ET-1；中药组、西药组可增加VEGF蛋白表达，减少bFGF、TGF-β1蛋白表达（均P＜0.05）。结论通脉颗粒能够促进损伤血管内皮细胞生长及内膜修复，其机制可能与降低血浆ET-1，升高血浆NO，增加VEGF，减少bFGF、TGF-β1蛋白表达有关，初步具有防治PIC术后再狭窄的作用。

【关键词】通脉颗粒PCI内皮素一氧化氮VEGF bFGF TGF-β1内膜修复

当今冠心病已严重威胁人类健康，经皮腔内冠状动脉介入术（PCI）成为冠心病的主要治疗方法之一，但术后再狭窄问题严重影响远期疗效［1］，经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）治疗后约30%患者发生再狭窄［2］。金属裸支架（BMS）植入术后再狭窄率较高，虽然药物支架（DES）能够降低患者再狭窄率［2-3］，但是仍然不能彻底解决PCI术后再狭窄的发生。防治支架内再狭窄（ISR）是目前医学界亟待解决的棘手问题和热点问题。冠心病PCI术后再狭窄属于中医学“胸痹心痛”的范畴，“气阴两虚、心血瘀阻”为其病机之一［4］，中医防治冠心病PCI术后再狭窄多以益气活血化瘀中药为主，临床观察亦证明疗效显著，因此中医药在预防和治疗PCI术后再狭窄方面前景广阔［5-6］。本研究通过观察具有益气养阴、活血通络功效的中药通脉颗粒对兔腹主动脉球囊损伤术后血清内皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）水平变化及血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子（TGF）-β1蛋白表达的影响，探讨中药通脉颗粒在预防和治疗冠脉介入术后再狭窄是否有较好的疗效及应用前景。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物新西兰大耳白兔48只，体质量（2.5± 0.5）kg，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。

1.2实验药物1）通脉颗粒由丹参、当归、人参、黄芪、川芎、麦冬组成，由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供。2）阿托伐他汀（立普妥，辉瑞制药有限公司，批准文号国药准字H95837003）。

1.3分组与造模将48只新西兰大耳兔按照随机数字表法分为正常组、模型组、通脉颗粒组（中药组）、阿托伐他汀组（西药组），每组各12只。模型组、中药组、西药组行手术造模。用20%乌拉坦溶液以5 mL/kg腹腔麻醉，取右股动脉区为手术区，备皮，消毒。切开皮肤钝性分离肌肉，分离右股动脉，穿刺右股动脉，逆行导入直径2.5或3.0 mm的球囊导管至腹主动脉，球囊加压充盈后（压力为4～6 kPa），缓慢回拉导管至切口处，拉伤长度约3 cm。重复上述过程反复3次，达到剥脱动脉内皮的目的，然后球囊减压撤出导管，结扎股动脉，缝合皮肤，连续肌肉注射青霉素40万单位3 d。

1.4给药方法正常组未经手术及用药；模型组术前、术后未用药；中药组于术前1 d开始给予通脉颗粒15.9 g/（kg·d），灌胃给药，连续用药21 d；西药组于术前1 d开始给予阿托伐他汀片1 mg/（kg·d）口服，连续用药21 d。

1.5标本采取1）血清的制备。造模3周，动物腹腔麻醉后，腹主动脉取血，分离血清，-70℃冰箱保存备用。使用时于37℃下溶化后，过0.22 μm滤膜过滤除菌。2）Western blot标本。造模3周，实验动物麻醉后，小心并迅速分离出腹主动脉，每只截取长约10 mm腹主动脉两段，分别用于RT-PCR和Western blot检测，0.9%氯化钠注射液冲洗后，立即置液氮内冻存。

1.6检测指标硝基还原酶法测定血清NO水平，放免法测定血清ET-1水平。Western法检测兔腹主动脉VEGF、bFGF、TGFβ-1蛋白表达。

1.7统计学处理应用SPSS16.0统计软件分析。计量数据以（±s）表示，先进行组间方差齐性检验，在方差齐的基础上作方差分析，组间两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组血NO及ET-1水平比较见表1。腹主动脉球囊损伤3周后，与正常组比较血浆NO水平明显降低（P＜0.01）；中药组、西药组与模型组比较可明显升高血浆NO水平（P＜0.01），与正常组比较血浆ET-1明显升高（P＜0.01）；中药组、西药组与模型组比较可明显降低血浆ET-1水平（P＜0.01）。

表1　各组兔血浆NO及ET-1含量比较（±s）

表1　各组兔血浆NO及ET-1含量比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别　n　NO（μmol/L）　ET-1（Pg/mL）西药组　12　12.7183±1.13483*△△38.8642±2.89005*△△正常组　12　18.5590±1.65050　27.6566±2.58870模型组　12　8.7991±0.71526*　85.1741±10.28795*中药组　12　12.3472±0.90273*△△42.1247±3.59299*△△

2.2各组VEGF、bFGF、TGF-β1蛋白结果比较见表2。腹主动脉球囊损伤3周后，与正常组比较腹主动脉VEGF、bFGF、TGF-β1蛋白表达均明显升高（P＜0.01）。中药组、西药组与模型组比较可明显增加VEGF蛋白表达（P＜0.05），降低bFGF、TGF-β1蛋白表达（P＜0.01）。

表2　各组VEGF、bFGF、TGF-β1蛋白结果比较（±s）

表2　各组VEGF、bFGF、TGF-β1蛋白结果比较（±s）

组别n　TGF-β1西药组　12　0.3310±0.03631*△△正常组　12　0.2257±0.03491模型组　12　0.4325±0.04592*中药组　12　0.3380±0.03681*△△VEGF　bFGF 0.3924±0.05634*△0.3218±0.02928*△△0.2373±0.02880　0.2057±0.02615 0.3291±0.06645*0.4632±0.04498*0.3932±0.05026*△0.3263±0.03004*△△

3　讨论

PCI术后再狭窄的机制十分复杂，目前认为各种原因引起的血管平滑肌细胞（SMC）增生，向内膜下迁移及合成大量细胞外基质从而引起内皮细胞增生是公认的再狭窄形成的主要机制［7］。目前的研究显示，NO 和ET-1是内皮细胞分泌的两种重要血管活性因子。NO可激活血管平滑肌细胞内的可溶性鸟苷酸环化酶，使环磷酸鸟苷含量升高，导致平滑肌细胞内钙减少，从而介导血管平滑肌的舒张［8-9］，并且能够抗血小板黏附和聚集，抑制血管平滑肌细胞增殖，抑制白细胞黏附、浸润等作用，从而发挥对抗PCI术后再狭窄的作用。ET-1能有效地收缩血管、促进血管平滑肌细胞增殖、迁移和促进细胞外基质积聚、加速生长因子和黏附分子等合成与释放［10］，增加新生内膜与中膜的比例，促使再狭窄形成。在PCI术过程中因机械牵拉、压迫血管内皮，使内皮细胞分泌ET-1增加，而分泌NO水平明显降低。VEGF能够促进内皮生长和新生血管生成，还能够促进纤溶酶活性、防止血栓形成、增加毛细血管通透性和舒张血管的作用［11］，因此在血管损伤修复和防止再狭窄中具有十分积极的意义。bFGF可以促进内膜增厚，球囊损伤后bFGF的释放增加，造成新生血管狭窄。多项研究表明［12］，在血管损伤后，TGF-β1蛋白增加。TGF-β对VSMC增殖具有双重效应，既可以促进VSMC由收缩型向合成型转化，引起VSMC增殖；又可以抑制VSMC的增殖［13］。本实验中，腹主动脉球囊损伤后，腹主动脉bFGF、TGF-β1表达升高，可能参与再狭窄的发生，VEGF可能通过促进血管内皮修复，防止再狭窄的发展。因此在PCI术后如何降低ET-1水平，而提高NO水平，促进内皮修复是预防PCI术后再狭窄新策略［14］。中医学对于PCI术后再狭窄做了大量的研究，也取得了一定成果。冠心病PCI术后再狭窄属于中医学“胸痹心痛”的范畴，“气阴两虚、心血瘀阻”为其病机之一［15］。《素问·举痛论》载“百病生于气也”。心主血脉，以气为用，故心气的盛衰和运行与血液循环有直接关系。冠心病行PCI术者多为中老年人，久病体虚脏腑功能减退，心气亦逐渐亏虚，加之久病伤津耗气。气虚则无以生血、行血，阴血亏虚则脉络不通［16］，二者均可致血液运行不畅，脉络不通，瘀血阻滞，以致发生狭窄。PCI术作为有创手术，虽可开通血络，但气阴亏虚之本依然存在，未从根本上祛除血瘀的原因，而中药通脉颗粒正是以益气养阴、活血通络为治疗原则。该药由丹参、当归、人参、黄芪、川芎、麦冬组成。方中人参大补元气，与黄芪共奏益气固本之效，麦冬滋阴益胃、养阴润肺三者合用起到益气养阴治本的效果。当归养血、活血、通经，丹参活血、化瘀、止痛，川芎活血、行气、止痛，三者起到活血通络治标的效果。全方散中有补，诸药配合，标本兼治，能够促进损伤血管内膜修复，减轻内皮细胞增生，防止再狭窄的发生。

本实验表明具有益气养阴、活血通络功效的通脉颗粒能够能够减轻血管内膜增生，促进内皮细胞生长及内膜修复，具有防治PIC术后再狭窄的作用，对我国防治PCI术后再狭窄中药药物的研发提供新的思路，亦对临床用药有指导作用。

参考文献

［1］陈晓洋，涂良珍.冠心病PCI术后再狭窄的临床分析［J］.心血管康复医学杂志，2011，20（4）：361-364.

［2］Dangas GD，Claessen BE，Caixeta A，et al.In-stent restenosis in the drug-eluting stent era［J］.Journal of the American College of Cardiology，2010，56：1897-1907.

［3］袁晋青，徐波，高润霖，等.药物洗脱支架与金属裸支架对冠状动脉临界病变的远期疗效［J］.中国循环杂志，2010，25（1）：11-13.

［4］商晓明，曾庆明，江龙凤，等.中医药对冠心病PCI术后再狭窄炎症反应因子研究进展［J］.中医临床研究，2014，（1）：138-140.

［5］时广容，宫丽鸿，徐琳，等.桃核承气改良方对兔血管内膜剥脱术后内皮素和一氧化氮及一氧化氮合酶的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12（20）：3837-3840.

［6］商晓明，曾庆明，江龙凤，等.中医药对冠心病PCI术后再狭窄炎症反应因子研究进展［J］.中医临床研究，2014，6（1）：138-140.

［7］周江，郭靖涛，王福华，等.血管内皮生长因子与急性心肌梗死介入治疗术后再狭窄研究进展［J］.河北医学，2014，16（12）：2138-2141.

［8］Lindner V，Reidy MA.Proliferation of smooth muscle cells after vascular injury is inhibited by an antibody against basic fibroblast growth factor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88 （9）：3739-3743.

［9］黄震华.恢复血管内皮完整性和预防冠状动脉内介入治疗后再狭窄［J］.中国新药与临床杂志，2008，27（7）：523-526.

［10］Kawahara S，Umemoto S，Tanaka M，et al.UP regulation of Akt and eNOS induces vascular smooth muscle cell differentiation in hypertension in vivo［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2005，45（4）：367-374.

［11］Galaria II，Nicholl SM，Roztocil E，et al.Urokinase induced smooth muscle cell migration requires PI3-K and Akt activation［J］.J Surg Res，2005，127（1）：46-52.

［12］杨莺，吴凤兰，李文杰，等.益气养阴通络法对兔腹主动脉球囊损伤术后VEGF、bFGF、TGFβ1表达的影响［J］.中国中医急症，2013，22（1）：20-22.

［13］张敏.抗VEGF治疗对新生血管纤维化的影响［D］.济南：济南大学，2014.

［14］Serruys PW，Feyter P，Macaya C，et al.Fluvastatin for prevention of cardiac events following successful first prcutaneous coronary intervention［J］.JAMA，2002，287（24）：3215-3222.

［15］王杨春.PCI术后再狭窄——病理生理、诊断和中西医防治［D］.成都：成都中医药大学，2006.

［16］何劲松，刘婧，白法文，等.中医药防治冠心病PCI术后再狭窄的研究进展［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2011，9 （5）：599-600.

·研究报告·

The Effect of Yiqi Yangyin Tongluo Method on Endothelial Function after Endarterectomy of Abdominal Aorta in Rabbits

WANG Kuiying，LIU Tong，YANG Ying.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China.

【Abstract】Objective：To investigate the feasibility of Yiqi Yangyin Tongluo of Tongmai particles in Prevention efficacy of restenosis after Percutaneous coronary intervention（PCI）.Methods：48 New Zealand rabbits were randomly divided into four groups，the normal group，the model group，Tongmai Particles group（TCM group），and atorvastatin group（western medicine group），12 in each.The normal group received no surgery and medicine，while the other groups were modeled with balloon catheter denudation rabbit abdominal aorta surgery.The model group remained untreated before and after surgery；a day before surgery，TCM group were administered with Tongmai Particles，continuous medication for 3 weeks，while western medicine group took atorvastatin orally，continuous medication for 3 weeks，too.After three weeks，blood was taken to test endothelin（ET-1）and nitric oxide（NO）.Protein expression of VEGF，bFGF TGFβ-1 of abdominal aorta in rabbit was detected with Western method.Results：NO rose and ET-1 reduced in plasma in both TCM group and western medicine group；in Chinese medicine group and western medicine group，the protein expression of VEGF could increase and the protein expression of bFGF and TGFβ-1 could reduce（P＜0.05）.Conclusion：Tongmai Particles can promote growth and endometrial repair of vascular endothelial cell，which may be associated with the decrease of plasma ET-1，rise of plasma NO，increase of VEGF and reduce of protein expression of bFGF and TGFβ-1，initially play a role in Prevention of surgery PIC restenosis.

【Key words】Tongmai particles；PCI；Endothelin；Nitric oxide；VEGF；bFGF；TGFβ-1；Endometrial repair

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）04-0609-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.013

*基金项目：辽宁省教育厅科研课题（L2012347）

通信作者△（电子邮箱：174813674@qq.com）

收稿日期（2015-10-02）