连豆清脉方对SD大鼠动脉粥样硬化形成的预防作用及NF-κB信号通路的影响*

朱红俊　陆曙　苏伟　龚少愚　陈浩　周春刚　刘钰龙　谈晓东（南京中医药大学无锡附属医院，江苏　无锡　214071）



连豆清脉方对SD大鼠动脉粥样硬化形成的预防作用及NF-κB信号通路的影响*

朱红俊陆曙△苏伟龚少愚陈浩周春刚刘钰龙谈晓东
（南京中医药大学无锡附属医院，江苏无锡214071）

【摘要】目的研究连豆清脉方对大鼠动脉粥样硬化（AS）形成的预防作用，以及对核因子-κB（NF-κB）炎症信号通路中Toll样受体-4（TLR-4）、NF-κB、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1（PARP-1）的影响。方法50只大鼠随机分为基础组10只、空白预防组（空预组）10只、模型组10只、辛伐他汀预防组（辛预组）10只、连豆清脉方预防组（连预组）10只；后4组大鼠通过高脂饲料喂养建立早期AS模型，同步采用连豆清脉方、辛伐他汀，分别对大鼠AS模型进行预防性干预。并对主动脉血管壁厚度、组织PARP-1阳性细胞表达率、外周血单个核细胞TLR-4 mRNA表达、血清NF-κB水平检测计算。结果1）光镜下大鼠主动脉血管壁厚度存在差异（P＜0.01），连预组和辛预组大鼠主动脉血管壁厚度明显薄于模型组（P＜0.01），但是和空预组比较差异无统计学意义。免疫组化染色光镜下大鼠左心室组织PARP-1表达具有显著差异，PARP-1阳性细胞表达率存在统计学差异（P＜0.01），连预组和辛预组PARP-1阳性细胞表达率明显低于模型组（P＜0.01），但是明显高于空预组（P＜0.01），具有统计学差异。2）大鼠外周血单个核细胞TLR-4 mRNA表达各组间存在统计学差异（P＜0.01），连预组和辛预组TLR-4 mRNA表达明显低于模型组（P＜0.01），且连预组低于空预组（P＜0.05）。大鼠血清NF-κB水平各组间存在差异（P=0.001）；其中连预组NF-κB水平明显低于模型组（P＜0.01），但与空预组比较差异无统计学意义。结论连豆清脉方可预防高脂饮食导致的AS形成；其机制与抑制NF-κB炎症信号通路PARP-1、TLR-4、NF-κB等环节有关。

【关键词】动脉粥样硬化连豆清脉方辛伐他汀多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1 Toll样受体-4核因子κB

动脉粥样硬化（AS）的病理环节之一是众多因子相互交联，相互作用，扩大炎症反应的级联［1］。而抑制核因子-κB（NF-κB）的激活是血管炎症中心转录的控制点。NF-κB炎症信号通路涵盖了Toll样受体（TLR）、NF-κB、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）等多个环节，其中TLR识别炎症刺激，激活NF-κB［2］，活化的NF-κB向细胞核内转移，激活PARP-1［3］，从而促进下游炎症因子的表达，促进AS的发生与发展。而中医药可以有效干预AS炎症反应降低NF-κB、TLR-4等表达［3］。我们前期研究也证实，连豆清脉方可以抑制冠心病患者的白介素-6（IL-6）、高敏C反应蛋白等炎症指标［4-5］。但是中医药对NF-κB炎症信号通路进行相对系统性的研究未见有文献报道。对于中医药干预AS 的PARP-1表达的研究较少。因此，本研究通过连豆清脉方的预防性干预，观察了连豆清脉方对AS的预防作用及其对NF-κB信号通路相关环节的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1试验动物试验大鼠为8周龄，清洁级，雄性SD大鼠，体质量（220±18）g。分笼饲养，饲养环境：室温（22±4）℃，光照与黑暗循环时间为12 h。试验大鼠生产许可证号：扬州大学比较医学中心，SCXK（苏）2012-0004。清洁级试验大鼠饲养环境许可证号：江苏省血吸虫病防治研究所动物试验中心，SYXK（苏）2012-0034。

1.2饲料及药品1）普通标准饲料由动物试验中心提供。其他饲料由南京爱立默科技有限公司制作。2）高脂饲料处方参考文献资料［6］拟定：82.3%大鼠标准饲料、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白砂糖。3）连豆清脉方处方组成：连翘15 g，黄连3 g，野料豆15 g，牡丹皮10 g，知母10 g，赤芍10 g，莱菔子10 g。功效：清热、泄浊、补肾。药材采用江阴天江药业有限公司颗粒剂型。按照药物∶高脂饲料=2∶18的比例，制作成大鼠连豆清脉方高脂饲料。4）辛伐他汀由无锡市中医医院药房提供，商品名舒降之，由杭州默沙制药有限公司生产，国药准字H10970385。按照药物∶高脂饲料=0.7 mg∶20 g的比例制作成大鼠辛伐他汀高脂饲料。

1.3给药方法大鼠自由饮水。每周称量大鼠体质量，按照大鼠每千克体质量药物剂量为人标准体质量（50 kg）每千克体质量剂量的7倍计算［7］药物饲料量，折合：连豆清脉方10 g/kg体质量；辛伐他汀2.8 mg/kg体质量。药物饲料吃完后，不足部分采用高脂饲料补充。

1.4分组与干预方法根据参考文献［6，8］方法，采用高脂饲料喂养建立大鼠早期AS模型，同时进行预防性干预，观察药物预防AS形成的效果。试验干预与分组如下。1）取8周龄清洁级雄性大鼠50只，所有大鼠标准饲料适应性喂养1周，剔除饲食异常者。1周后，随机处死10只大鼠（基础组），留取外周血、大动脉、心脏组织等试验标本。2）剩余40只大鼠进行分组。按照随机数字表，随机分成4组：空白预防组（空预组）10只，连豆清脉方预防组（连预组）10只，辛伐他汀预防组（辛预组）10只，模型组10只。3）空预组给予普通标准饲料喂养；模型组予高脂饲料喂养；预防组给予对应的连豆清脉方药物饲料、辛伐他汀药物饲料，均喂养4周。4周后处死大鼠，留取外周血、大动脉、心脏组织等试验标本。

1.5检测方法1）TLR-4 mRNA表达根据文献［9］RT-PCR方法检测，采用SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ试剂盒（TAKARA DRR083S）以及LightCycler480 PCR仪（德国ROCHE）检测。TLR-4 mRNA的表达程度采用相对定量计算，标准化比值计算公式采用2-ΔΔCT法［10］，通过2%琼脂糖凝胶电泳和基因测序确定产物表达的准确性（图1，图2）。大鼠目的基因和内参基因引物序列见表1，由上海博彩生物科技有限公司合成。2）大鼠血清NF-κB水平检测采用酶联免疫分析（ELISA）方法进行检测，检测方法：采用BlueGene公司产品，产品编号E02N0011，检测步骤按照说明书进行。3）大鼠主动脉血管厚度采用Image-Pro Plus Version 6.0病理图像分析系统测量，以主动脉血管外膜基膜至血管内膜表面的最大垂直厚度为测量值。左心室组织PARP-1的表达采用免疫组化方法进行检测，检测方法参考文献方法［11］进行：一抗采用ABcam公司的Anti-PARP-1 antibody，货号AB6079。

表1　大鼠TLR-4引物序列

图1　大鼠凝胶电泳图

1.6统计学处理应用SPSS16.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示；多组组间整体比较采用单因素方差分析；组内两两比较采用最小显著差数法（LSD）分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

图2　大鼠TLR-4 TA克隆试验测序图

表2　大鼠主动脉血管壁厚度及组织PARP-1阳性细胞表达率（±s）

表2　大鼠主动脉血管壁厚度及组织PARP-1阳性细胞表达率（±s）

与基础组比较，*P＜0.01；与空预组比较，△P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.01。下同。

组别　n　主动脉血管壁厚度（Pixels）阳性细胞表达率（个/HP）基础组　10　118.69±8.15　0.40±0.52空预组　10　124.19±4.52　1.60±1.35辛预组　10　127.60±9.61▲　5.20±6.04△连预组　10　122.67±6.71▲　4.70±3.40△▲模型组　10　277.85±19.26*△　15.70±3.09△

图3　各组大鼠主动脉切片（HE，×100）

图4　各组大鼠主动脉切片（免疫组化染色，×200）

2　结果

2.1大鼠主动脉切片比较见表2，图3，图4。HE染色光镜下显示血管壁厚度存在差异（P＜0.01），连预组和辛预组大鼠主动脉血管壁厚度明显薄于模型组（P＜0.01），但是和空预组比较主动脉血管壁厚度差异无统计学意义。光镜下大鼠左心室组织PARP-1表达免疫组化染色切片具有显著差异，PARP-1阳性细胞表达率存在明显差异（P＜0.01），连预组和辛预组PARP-1阳性细胞表达率明显低于模型组（P＜0.01），但是明显高于空预组（P＜0.01）。

2.2大鼠外周血单个核细胞TLR-4 mRNA表达及血清NF-κB水平比较见表3。大鼠外周血单个核细胞TLR-4 mRNA表达各组间存在明显差异（P＜0.01），连预组和辛预组TLR-4 mRNA表达明显低于模型组（P＜0.01），且连预组低于空预组（P＜0.05）。大鼠血清NF-κB水平各组间存在差异（P = 0.001）；其中连预组NF-κB水平明显低于模型组（P＜0.01），但与空预组比较差异无统计学意义。

表3　大鼠外周血单个核细胞TLR-4 mRNA表达及血清NF-κB（±s）

表3　大鼠外周血单个核细胞TLR-4 mRNA表达及血清NF-κB（±s）

组别　n　外周血单个核细胞TLR-4 mRNA　血清NF-κB水平（ng/L）基础组　10　0.63±0.25　0.22±0.20空预组　10　1.00±0.00*　0.32±0.26辛预组　10　0.58±0.29▲　0.43±0.13*连预组　10　0.7±0.27△▲　0.34±0.21▲模型组　10　1.56±0.64*△　0.60±0.12*△

3　讨论

炎症反应机制参与AS发病起始和整个疾病过程［12］，其中IL-6可引发血管内皮功能失调，加速动脉硬化［13］，冠脉粥样硬化斑块局部和粥样硬化损伤的动脉壁上IL-6的表达量是正常组织的10～40倍［14］。但是，炎症反应是受到上游炎症反应信号通路调节的，在AS发生机制方面，以对NF-κB信号通路研究最为广泛成熟。

目前认为，NF-κB通路通过激活NF-κB，进而调控很多关键致炎症因子的表达，而这些炎症因子也受到PARP的调节［15］，过量激活的PARP1在恶性炎症机制中起着重要作用［16］。PARP抑制剂处理或敲除PARP基因的细胞或小鼠中，NF-κB活性和NF-κB依赖性炎症基因都降低［17］。文献研究也证实，抑制PARP可以减缓炎症因子如肿瘤坏死因子-α、IL-6的增加［18］等。因此，有学者认为PARP、NF-κB信号通路在动脉粥样硬化中的相互作用是非常值得关注的研究领域［17］。

中医药对NF-κB炎症信号通路进行相对系统性的研究未见有文献报道。对于中医药干预AS的PARP-1表达的研究较少，我们前期研究已经证实，连豆清脉方可以降低人外周血IL-6等炎症指标，抑制冠心病患者的炎症反应。但是，前期尚未进行连豆清脉方预防AS形成的研究。

中医药在预防疾病方面具有良好效果，这是被公认的事实，并被现代研究所证实。研究发现，葡萄籽原花青素具有阻止AS早期主动脉壁粥样硬化发展的作用［19］；丹参可调节Bcl-2/Bax表达抑制AS斑块形成［20］；姜黄抑制巨噬细胞mRNA合成，预防动脉硬化；绞股蓝对高胆固醇饲料饲养兔AS与辛伐他汀有相似的干预作用［21］；三七总皂苷具有预防AS的作用［22］等。但是使用中医药复方预防AS的研究文献较少。汤诺等采用中药复方——舒心饮能预防AS，延缓AS进程，其机制可能和抑制炎症反应启动和致炎因子的激活有关［23］。

我们认为，AS的发生和热、痰、瘀三因合而化浊的“痰瘀化浊”的发病机制有关［24］，而连豆清脉方由连翘、黄连、野料豆、牡丹皮、知母、赤芍、莱菔子等药物组成，具有清热补肾泄浊的作用，对AS的预防应该会有较好的效果。结合现代中药药理研究，连豆清脉方的组成中药具有抗菌、抗炎、降压、调血脂、抗氧化等多种药理作用，如黄连和吴茱萸配伍，可以预防高脂血症发生［25］。这些文献和研究进一步提示连豆清脉方可能具有良好的预防AS效果。

本文研究结果也证实，在连豆清脉方的预防性干预下，大鼠主动脉血管壁厚度明显薄于模型组，差异具有统计学意义，接近于空预组，提示连豆清脉方可以抑制高脂饮食诱发的AS的发生和发展速度，显示出较好的实际预防AS效果。而通过对含冠脉的左心室组织免疫组化染色病理分析也发现，在连豆清脉方的预防性干预下，组织的PARP-1阳性细胞表达率明显低于模型组，但是明显高于空预组，具有统计学差异。提示连豆清脉方预防AS的机制可能和降低PARP表达抑制AS炎症反应有关。外周血TLR-4 mRNA表达和血清NF-κB表达的分析结果也证实这一点。大鼠外周血单个核细胞TLR-4 mRNA表达明显低于模型组，也低于空预组；同时，大鼠血清NF-κB水平也明显低于模型组，具有统计学差异，可以说明连豆清脉方预防大鼠AS形成的机制与抑制NF-κB炎症信号通路有关，作用位点涵盖了NF-κB信号通路中TLR、NF-κB、PARP等多个环节。

综上分析，连豆清脉方可预防高脂饮食导致的AS形成；其机制与抑制NF-κB炎症信号通路PARP-1、TLR-4、NF-κB等环节有关。

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Effects of Liandou Qingmai Decoction on Preventing Atherosclerosis and Nuclear Factor Kappa B Inflammatory Signal Pathway

ZHU Hongjun，LU Shu，SU Wei，et al.Heart Internal Medicine Department，Wuxi Hospital Affiliated to Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Wuxi 214071，China.

【Abstract】Objective：To observe the effects of Liandou qingmai decoction on preventing atherosclerosis（AS）and nuclear factor kappa B（NF-κB）inflammatory signal pathways.Methods：50 rats were randomly divided into the basic group，the blank group，the model group，simvastatin prevention group，Liandou Qingmai decoction prevention group，10 rats in each.Rat′s model of early AS was established by fat feeding.And preventive interventions were done on the models with Liandou qingmai decoction and simvastatin respectively.The levels of poly adenosine diphosphate ribose polymerase-1（PARP-1），Toll-like receptor-4（TLR-4）mRNA，NF-κB，interleukin-6（IL-6）and interleukin-10（IL-10）were measured.Results：There were significant differences in the average positive expression rates of PARP-1，TLR-4 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells，the levels of NF-κB in Serum among basic group，blank group，high lipid group（HLG），Simvastatin prevention group （SPG）and Liandou qingmai decoction prevention group（LPG）.The positive expression rates of PARP-1，TLR-4 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells，the levels of NF-κB in Serum of HLG were significant higher than SPG′s and LPG′s.Conclusion：Liandou qingmai decoction can significantly prevent the formation of AS in rats caused by high fat diet and inhibit NF-κB inflammatory signal pathway.

【Key words】Atherosclerosis；Liandou qingmai decoction；Simvastatin；Poly adenosine diphosphate ribose polymerase-1；Toll-like receptor-4；Nuclear factor kappa B

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）04-0601-05

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.011

*基金项目：江苏省中医药局资助项目（No.HZ07097）；无锡市医院管理中心医学科研面上项目（No.YGZXM14043）

通信作者△（电子邮箱：z7h6j@163.com）

收稿日期（2015-11-02）