水杨酸钠对大鼠下丘多巴胺水平影响的研究

刘俊秀刘轶君毛兰群李学佩马芙蓉北京大学第三医院耳鼻咽喉科（北京009）中国科学院化学研究所（北京0090）华信医院急诊科（北京0006）



水杨酸钠对大鼠下丘多巴胺水平影响的研究

刘俊秀1刘轶君3毛兰群2李学佩1马芙蓉1
1北京大学第三医院耳鼻咽喉科（北京100191）
2中国科学院化学研究所（北京100190）
3华信医院急诊科（北京100016）

【摘要】目的探讨听觉中枢核团下丘内多巴胺水平的变化在耳鸣发病机制中的作用。方法在水杨酸钠诱导建立的耳鸣动物模型基础上，利用微透析技术结合高效液相电化学检测方法，活体、动态研究水杨酸钠作用后大鼠下丘内多巴胺水平的变化。结果水杨酸钠引起大鼠下丘多巴胺水平显著性地降低。大约3小时后下丘内多巴胺水平降至最低，达到基础值的49±9％，然后缓慢的升高，大约5小时后恢复到基线水平。生理盐水对照组未引起任何明显的变化。结论大鼠下丘内多巴胺水平的显著性降低可能与水杨酸钠诱导的耳鸣产生有关，这些活体数据为多巴胺这一调节人们精神活动的重要递质参与耳鸣的发生提供直接的实验证据。

【关键词】水杨酸钠；耳鸣；下丘；多巴胺；微透析；高效液相色谱

This research is financially supported by the NSF of China（30500556，21372020）and NSF of Beijing（7082100，7112144）.

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

面对临床上日益增多的耳鸣患者，学者越来越关注耳鸣患者所常常伴有的烦躁、易怒、焦虑及抑郁等精神症状，这些精神症状与耳鸣形成恶性循环，给患者带来极大的痛苦。有研究表明抑郁症和精神分裂等精神疾病在发病机制中与耳鸣有很多相似之处，甚至有学者研究认为一部分精神分裂症患者所谓的幻听实际上就是一种耳鸣［1-2］。

多巴胺（DA）是当前研究得最有成效的脑内神经递质之一。是调节人们精神活动和精神依赖的重要递质。中脑-边缘叶DA系统主要调控情绪，中脑-大脑皮层DA系统主要参与认知功能，对事物的识别能力。DA在抑郁症、精神分裂症中，都起到重要的作用。在众多的生物精神病学研究中，有的学者认为DA功能亢进是解释精神分裂症发病机制的主要生化假说［3］。研究者设想DA神经元系统失平衡可能是耳鸣的发病机制之一。听觉中枢单胺类神经介质与耳鸣的关系问题一直是近些年的研究热点。

因此本研究拟在经典的水杨酸钠诱导的耳鸣动物模型的基础上，利用先进的微透析技术结合高效液相电化学检测方法在动物活体清醒状态下动态研究下丘这一重要的听觉中枢核团内多巴胺水平的变化，为多巴胺参与耳鸣的发生发展提供直接有意义的实验数据。

1　材料与方法

1.1动物分组

本研究选用16只Wistar大鼠，体重为300～350 g，购自北京大学医学部实验动物研究中心。将实验动物随机分成腹腔注射水杨酸钠（350 mg/Kg）耳鸣组（n = 8）和腹腔注射生理盐水对照组（n = 8）。将Wistar大鼠置于能够自由饮水和取食的清醒装置转盘系统（BAS，美国）的动物盘中饲养一周，待其适应环境后进行微透析探针植入手术，恢复24小时，利用微透析技术结合电化学检测方法实时动态监测下丘神经核团内多巴胺水平的变化。本研究的试验过程符合中科院制定的动物管理条例。

1.2药品与试剂

抗坏血酸钠盐、DA，DOPAC，HVA，5-HIAA，5-HT标样及内标3，4-DHBA（3，4-dihydroxybenzylamine）购自Sigma或Aldrich公司。用0.1M的高氯酸配成约1.0×10-3M的储备液，临用前混合并用Ringer氏溶液稀释至所需浓度。Ringer氏液的组成为（mM）：NaCl 149；KCl 3；CaCl2 1.2；MgCl20.8，PH= 6.7。离子对试剂辛烷磺酸钠购自ACROS公司，乙腈为色谱纯（Fisher），水为去离子双蒸水，其余试剂均为国产分析纯。

1.3微透析探针植入手术

采用1.5％的戊巴比妥钠溶液，按照44 mg/Kg的剂量对大鼠实施麻醉。动物麻醉后固定在大鼠脑立体定位仪上，用自制恒温垫维持大鼠体温为37μl。以前囟点作为坐标原点，参照解剖图谱确定下丘神经核团的位置（前囟后= 8.8mm；左右= 2.0mm；深度= 3.5mm）。在颅骨表面打孔，将微透析探针（MD-2200，探针尖端直径2 mm，BAS）植入左侧海马，并用骨钉和牙科水泥进行固定。术后将大鼠放入清醒装置动物转盘中。术后恢复24小时后，进行微透析取样，控制流速为3 μL /min。试验结束后，以过量注射戊巴比妥钠的方式处死大鼠。通过微透析探针注入甲苯胺蓝进行染色，进行连续脑切片以确认微透析探针植入的位置。

1.4微透析及多巴胺检测

多巴胺的检测采用微柱高效液相电化学检测方法，检测装置为LB－1型微量色谱泵（1－999 μL/ min，北京星达公司）；电化学检测器为EG&G 174A极谱分析仪（美国），检测池为LC－4C型安培检测池（日本），工作电极为玻碳电极（6mm），膜厚15 μL，有效池体积约为0.42 μL；Ag/AgCl为参比电极，不锈钢为辅助电极，工作电压设为+0.75V。

1.5数据分析

透析液中多巴胺的水平（χ±S）用相对于基础值的百分比来表示。统计分析方法使用重复测定的双因素方差分析（ANOVA）并以腹腔注射药物的处理条件作为主要影响因素。P＜0.05认为差异具有显著性（双尾法）。

2　结果

2.1耳鸣动物模型下丘透析液多巴胺（DA）水平变化

下丘内多巴胺的基础值浓度分别是18±2.1 fmol/5 μl（n = 16）。水杨酸钠（350 mg/kg i.p.，n = 8）显著性地降低下丘DA水平，大约3小时后下丘DA降至最低，达到基础值的49±9％，然后缓慢的升高，大约5小时后恢复到基线水平。对照组（n = 8），生理盐水并未引起任何显著性的改变。双因素方差分析显示水杨酸钠和生理盐水这两种处理因素之间差异具有显著性意义F0.05（1，14）= 6.117，P = 0.043），组内时间因素之间的差异具有显著性意义F0.05（19，152）= 46.842，P＜0.000001），时间和处理因素的交互效应仍具显著性意义F0.05（19，152）= 29.654，P＜0.000001）。

图1　水杨酸钠对下丘DA水平的影响Fig.1 The effect of salicylate on the dopamine in inferior colliculus

黑色方块点线代表水杨酸钠组多巴胺的变化（n=8），红色圆点线图代表对照组多巴胺的变化（n= 8）。箭头显示开始给予水杨酸钠腹腔注射的时间。注射药物前取2个样品作为基础值。腹腔注射水杨酸钠引起大鼠下丘多巴胺水平显著性降低，而腹腔注射生理盐水后多巴胺水平无明显变化（P＜0.000001）。

2.2甲苯胺蓝染色组织切片显示探针植入的位置（图2）

图2　微透析探针植入下丘的组织切片Fig.2 The tissue slices with implanted microdialysis probes

3　讨论

利用微透析这种活体、动态、连续的生化取样技术研究水杨酸钠引起大鼠耳鸣病理过程中下丘这一重要听觉中枢神经核团神经递质的变化对于阐明耳鸣神经生理学机制具有重要的生物学意义。微透析技术一改先处死动物，再将组织匀浆后取样的传统方法，使以往一筹莫展的活体动态生化分析成为可能，特别是该技术可以在基本不破坏生物体内环境的基础上专门从局部神经核团中提取出具有重要生物学意义的细胞外液进行检测，更是传统方法望尘莫及的，更能真实地反映出在水杨酸钠导致的耳鸣过程中下丘内多巴胺水平的变化。

本研究利用微透析技术结合高效液相电化学分析方法检测到下丘神经核团内多巴胺的基础生理水平为18±2.1 fmol/5 μl（n = 16），与既往文献结果大致相符。腹腔注射水杨酸钠（350 mg/kg i.p.，n =8）引起下丘多巴胺水平显著性地降低，大约3小时后下丘多巴胺降至最低，达到基础值的49±9％，然后缓慢的升高，大约5小时后恢复到基线水平。而生理盐水对照组并未引起任何显著性的改变。因此得出初步的结论下丘内多巴胺水平的显著性降低可能与水杨酸钠所诱导的耳鸣产生有关。既往有学者研究显示噪声刺激下耳蜗内多巴胺因消耗其含量是降低的［4］。还有研究显示长时间强噪声暴露下大鼠脑内多巴胺的含量也是降低的［5］。新进研究表明多巴胺能通路可能参与了耳鸣情感调控，多巴胺能药物能提高丘脑感觉信号放电，同时在耳蜗多巴胺有抑制作用，可能参与早期耳鸣形成［6］。因此已经有临床实验证明多巴胺受体激动剂普拉克索可以有效治疗老年性耳聋所伴有的神经性耳鸣［7］。

随着对多巴胺神经递质以及受体在耳鸣的发病机制中的作用不断深入研究，相信一定为耳鸣的治疗提供更精准的药物作用靶点。

参考文献

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3Salmas RE，Yurtsever M，Durdagi S.Atomistic Molecular Dynamic Simulations of Typical and Atypical Anti-psychotic Drugs at the Dopamine D2 Receptor（D2R）Elucidates Their Inhibition Mechanism.J Biomol Struct Dyn.2016；29（2）:1-37.

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6Langguth B，Elgoyhen AB.Current pharmacological treatments for tin.nitus.Expert Opin Pharmacother，2012；13（17）:2495-2509.

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Effects of salicylate on dopamine levels in rat inferior colliculus

LIU Junxiu1，LIU YIjun3，MAO Lanqun2，LI Xuepei1，MA Furong1
1Department of Otorhinolaryngology，Peking University Third Hospital，Beijing，100191，China
2Institue of Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Beijing，100190，China
3 Emergency Department，Huaxin Hospital，Beijing，100016，China
Corresponding author:MA FurongEmail:furongma@126.com

【Abstract】Objective To investigate dopamine level changes in the inferior colliculus induced by salicylate and the role of dopamine in the mechanisms of tinnitus.Methods In an animal model of salicylate-induced tinnitus，we employed microdialysis combined with electrochemical methodologies to monitor changes of dopamine in rat inferior colliculus.Results Salicylate produced significant decrease in dopamine levels in the inferior colliculus，to a minimum of 49±9％of baseline around 3 h post injection，followed by a return to the baseline by the end of the fifth hour.In contrast，saline did not produce any clear changes.Conclusion The decrease of dopamine in the inferior colliculus may be involved in the generation of tinnitus.Our in vivo data provide direct evidence of the important roles the dopaminergic system plays in the generation of tinnitus.

【Keywords】sodium salicylate，tinnitus，inferior colliculus，dopamine，microdialysis，high performance liquid chromatography

【中图分类号】R764.45

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）02-167-3

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.008

基金项目：国家自然科学基金项目（30500556、21372020）和北京市自然科学基金项目（7082100、7112144）联合资助

作者简介：刘俊秀，博士，副主任医师，研究方向：耳科学、鼻科学。

通讯作者：马芙蓉，Email：furongma@163.com

收稿日期：（2016-03-24）