减毒单增李斯特菌疫苗递呈研究进展①

丁承超　陈国薇　吴　嫚　刘武康　刘　箐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

·专题综述·

减毒单增李斯特菌疫苗递呈研究进展①

丁承超陈国薇吴嫚刘武康刘箐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一种革兰氏阳性兼性厌氧胞内寄生条件致病菌。该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障,引起人和动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症[1]。且具有独有的胞内逃逸存活和胞间传送等特性，因此是研究胞内寄生的模式细菌。目前研究发现Lm的毒力主要由六个毒力因子编码基因(prfA-plcA-hly-mpl-actA-plcB)组成。plcA和plcB分别编码磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)和卵磷脂酶(PC-PLC)，有助于Lm逃离吞噬小体；actA与基于Lm肌动蛋白的运动性有关；hly则与Lm的溶血素有关，参与单增李斯特菌一级和次级吞噬小体的逃离；prfA主要调控Lm的侵袭相关毒力因子，如inlA和inlB等；mpl是一个依赖锌的金属蛋白酶基因[2，3]。以“Listeriamonocytogenes+vaccine”为关键词在Medline进行检索发现，截至(2015/05/06)为止，共有703篇关于Lm作为疫苗载体的研究，其中近五年相关研究为301篇。这些研究表明，Lm能够同时引起MHCⅠ和MHCⅡ类抗原递呈系统，具有显著激发强烈的CD8+和CD4+细胞免疫的能力。同时，减毒Lm作为口服疫苗载体可以调动机体的黏膜免疫效应[4]。近年来随着对单增李斯特菌毒力基因、跨膜转运机制研究的不断深入，以及平衡致死载体和细菌表面展示等技术的快速发展，进一步证明了减毒单增李斯特菌作为高效递呈抗原活载体的实用价值。迄今为止减毒Lm活载体疫苗已成功应用于人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)、人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)和转移性胰腺癌等[5-7]人类复杂疾病的免疫治疗中。

1减毒Lm的免疫机理及途径

单增李斯特菌具有典型的胞内寄生和胞间传递等特性，减毒后作为疫苗载体，能够同时引起MHCⅠ和MHCⅡ抗原递呈系统，刺激机体产生强烈的细胞免疫反应。因此单增李斯特菌已成为最重要的减毒活载体疫苗载体之一。减毒Lm作为疫苗载体有两条抗原递呈系统[8,9](如图1所示)，其一是交叉递呈途径(Cross-presentation pathways)，即Lm被宿主吞噬细胞等细胞捕获并降解后，细菌多肽被树突状细胞(Dendritic cell，DC)通过细胞受体、内吞等作用摄入细胞内，再经MHCⅠ和MHCⅡ两条途径分别递呈给CD8+和CD4+T细胞；另外一条是传统的递呈途径(Classical pathways),即Lm进入细胞后，绝大部分Lm被溶酶体所包裹降解，降解的抗原通过MHCⅡ递呈给CD4+T细胞，另外有5%～10%的Lm可通过其特有的毒力蛋白LLO降解溶酶体膜后逃逸，逃逸出来的细菌分泌的蛋白被蛋白酶体降解加工后通过MHCⅠ递呈给CD8+T细胞。Lm从噬菌体的逃逸能力为其独有，逃逸的Lm在细胞质中表达抗原基因对抗原递呈至关重要，也是其作为减毒载体的最大优势。

图1　Lm抗原递呈途径[9]Fig.1　Vaccine delivery of Lm[9]

2减毒Lm作为疫苗载体的优势

1990年，Wolff等[10]将裸露的脱氧核糖核酸注射给小鼠能引起外源基因的长期表达，由此诞生了脱氧核糖核酸免疫技术，使得DNA疫苗成为继减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗之后的又一新型疫苗，被誉为第三次疫苗革命。在此后的20多年间，由此引发的DNA疫苗、基因工程疫苗等研究成为疫苗研究的热点。在实际运用中发现，这种裸露的DNA极易受到环境及宿主的降解，如何能将这些抗原基因在有保护的状态下递送给免疫对象成为疫苗开发必须解决的问题。细菌、病毒等微生物本身具有入侵并启动宿主免疫系统的原始本能，早在一个世纪以前,纽约大夫Coley[11]惊讶地发现将灭活的革兰氏阳性菌或阴性菌注射进入肿瘤组织后肿瘤出现消退现象。这是第一次将细菌用于肿瘤控制的“原始疫苗载体”。此后有大量研究显示，微生物疫苗载体在肿瘤控制中有良好的靶向性和控制力,甚至发现某些病原微生物似乎对肿瘤组织有一定的“偏好”[12]。因此，经过毒力基因的减毒，携带靶标抗原的减毒活载体疫苗迅速成为新型疫苗研究的热点。

迄今为止，已开发的减毒疫苗微生物载体包括细菌，如沙门氏菌(Salmonella)、单增李斯特菌、乳酸杆菌(Lactobacilli)等，病毒如腺病毒、疱疹病毒，真菌如酿酒酵母等，与其他疫苗载体或者佐剂相比，微生物载体具有以下优势:①部分病原微生物偏好入侵抗原提呈细胞比如树突状细胞(Dendritic cell，DC)，抗原递呈效果好；②可穿透肠道屏障通过血液循环远程递呈抗原；③抗原性良好，可刺激机体先天性和获得性免疫系统；④可携带多个抗原研发多价疫苗；⑤能穿透肠道屏障进入血液的疫苗载体，是口服式疫苗研发的最佳选择[13]。但值得注意的是，虽然微生物减毒疫苗载体一出现，就表现出极大的优势和良好的应用前景，但其自身毒力基因的潜在安全性、对宿主基因表达的负面影响等也引起人们的关注。而与其他微生物疫苗载体如沙门氏菌相比，Lm存在明显的优势：①对环境耐受性强，可在较高的盐浓度(可高达40%NaCl)以及宽泛的pH(pH3～12)和温度范围(0～45℃)内生长，VazquezBoland等[14]研究发现Lm在16～30℃下，均可入侵鱼类细胞但30℃入侵最多，这种超强的环境适应能力拓宽了Lm载体疫苗的使用范围；②抗原递呈增强能力，Lm表面的脂胞壁酸质、肽聚糖、载脂蛋白等可与DC表面特异性Toll样受体结合，DC在识别这些抗原后可以通过调节CD80、CD86、MHCⅡ类分子及炎性分子如IL-12、TNF-α起到加强抗原提呈作用[15]；③较好的安全性，减毒后的Lm其毒性下降明显，如使hly基因发生突变，可使其毒力水平下降105数量级，敲除actA基因可使其毒力下降104数量级[16]。目前，以actA/plcB、actA/inlB、hly、prfA、actA等单个或者多个毒力基因敲除减毒的Lm已成功应用于肿瘤、病毒等DNA疫苗载体中，部分疫苗已经进入Ⅰ期、Ⅱ期临床实验；④多种抗原递呈能力，2006年，Loeffler等[17]发现减毒Lm不仅可以运送抗原蛋白，而且可以运送DNA和RNA，这种多种抗原的递呈能力为疫苗的免疫保护提供了更多选择；⑤口服免疫的最佳选择，2011年Whitney等[18]研究发现，当Lm作为HIV口服式疫苗时不会减弱抗HIV-gag的免疫效应。另外，目前并未发现Lm的胞内寄生和其致病性的必然关系，比如目前关于其致病性报道最多的是其可随食品传染人类并导致严重的致病甚至死亡，但对其原始宿主，如牛、猪、羊等畜类，并未发现其严重的致病性，这为其作为除人类之外的动物减毒疫苗载体提供了可能性。水产品也是Lm的寄主之一，现有研究发现Lm几乎可以寄生全部水产品，但并未有报道由其引发的水产品疾病爆发[19]。2001年Dietrich等[20]发现用Lm(EGD-e)分别感染鲤鱼上皮细胞、刀剑尾鱼胚胎细胞和黑色素瘤细胞三种细胞，Lm均可在24 h内高效入侵三种细胞且无差异。因此，早在1996年前后Horne(1997)、Menudier(1996)、Jeyasekaran(1996)等人就提出Lm有望在将来成为渔用疫苗载体[21-23]，但遗憾的是迄今为止并未发现以其为载体的渔用疫苗上市。

3减毒活载体疫苗载体构建及高效抗原递呈新策略

在活细菌作为疫苗载体的研究中，抗原基因通常克隆至相应质粒的多克隆位点进而整合至细菌染色体内，解决了抗原在递呈过程中容易降解、免疫原性易丢失等问题[24]。然而在抗原表达系统中质粒需要经过抗生素筛选，无法保证其安全性和免疫效果。首先，抗生素残留进入生物环境中会导致抗生素污染甚至引发细菌耐药性问题[25]；而且，在具有抗性的环境下抗原表达量会随着质粒丢失而下降，最终导致免疫效果低下[26]。因此，选择合适的抗原递呈方式是提高细菌载体疫苗免疫效果的有效手段。目前，减毒微生物递呈疫苗的新策略主要包括平衡致死载体和细菌表面展示技术。

3.1平衡致死载体系统(Balanced lethal vector system)该载体系统针对某些关系细菌生死的关键基因，采用“质粒携带，菌株缺失”的原则设计，使得菌株的存活依赖于质粒所携带的关键基因，从而提高质粒遗传稳定性并摆脱对抗生素的依赖。在针对Lm的研究中发现dal和dat基因分别控制D-丙氨酸消旋酶和D-丙氨酸转氨酶的合成，dal、dat基因双缺失的Lmdd无法合成细胞壁[27]。基于此原理构建的突变Lmdd菌株是目前最成功的减毒Lm疫苗载体。该系统构建原理是在Lm中敲除dal和dat基因，之后在穿梭载体中表达dal基因操纵子并筛选稳定的突变菌株，基于这种“平衡致死系统”构建的突变菌株无需抗生素筛选压力以确保减毒Lm的存活，有效地解决了最早的减毒活载体疫苗使用中抗生素污染问题，即“绿色减毒疫苗活载体”。 Gaia等[28]在利用减毒Lm作为猴免疾缺陷病毒(Simian immune virus,SIV)疫苗载体的研究中,构建Lmdd平衡致死载体并外源表达SIV-gag(如图2所示)。结果在口服接种猕猴后同时产生了针对SIV和Lm的细胞免疫反应。另外，其他平衡致死载体系统，如基于asd等基因缺失的载体系统已经成功应用于沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、爱德华氏菌等细菌载体疫苗的设计中[29-32]。

3.2细菌表面展示系统(Bacterial surface display system)免疫效果不佳是目前制约细菌载体疫苗临床应用的最大障碍，其原因在于外源抗原基因在伴随细菌进入宿主内表达量不足。目前解决此类问题的方法主要集中在如何使抗原基因在进入宿主机体后表达并分泌至细菌表面。表面展示技术使得抗原分泌至细菌表面，易被免疫系统识别。另外，细菌的脂多糖、外膜蛋白等能刺激机体产生非特异免疫。这种类似免疫佐剂功能的疫苗设计理念具有独特的优势[33]。目前在疫苗载体研究领域，表面展示技术已经成功应用于沙门氏菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌等[34-36]微生物。其基本原理(如图3所示)是将外源蛋白基因序列与特定的锚定蛋白基因序列融合后导入细菌宿主细胞，在信号肽的引导下融合蛋白向细胞外分泌，被展示的外源蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性[37]。由于革兰氏阴性菌遗传背景比较清楚,更便于控制蛋白的展示,因而研究主要集中在革兰氏阴性菌。而革兰氏阳性菌跨外膜转运机制尚不清楚,目前还未有将表面展示技术应用于Lm的研究报道。但从应用角度来看,革兰氏阳性菌的某些特性更适合于表面展示:首先,革兰氏阳性菌的蛋白表面展示系统有着相同或类似的表面锚定机制,允许多达几百个氨基酸的外源蛋白插入。再者,革兰氏阳性菌所展示的蛋白只需通过单个质膜层,而革兰氏阴性菌的展示蛋白不仅要通过质膜层还要在外膜上正确的整合,这对展示蛋白的结构和活性可能产生影响。而且,革兰氏阳性菌细胞壁较厚,因而更坚固而易于操作[38]。在不久的将来，随着革兰氏阳性菌外膜蛋白自主转运机制研究的不断深入，将表面展示技术应用于Lm以提高抗原递呈效率的方式可能成为现实。

图2　Lmdd-SIV-gag平衡致死载体系统的构建[29]Fig.2　Construction of Lmdd-SIV-gag[29]

4展望

疫苗递送系统与其产生的免疫效力直接相关，如何将免疫原高效地送到MHCⅠ和MHCⅡ类分子并提呈至细胞表面是目前该领域的研究热点。Lm全基因组2001年测序成功至今才15年，其作为疫苗载体的潜力仍未完全开发。除平衡致死载体和细菌表面展示技术外，很多高效递呈疫苗的新策略还未应用于Lm疫苗载体的研究中。如Guan等[40]将二元调控机制引入重组大肠杆菌作为疫苗载体的研究中，当大肠杆菌携带抗原进入机体后，PviuB调控机制作用从而诱导抗原基因表达。此类调控机制在高效表达抗原方面具有独特优势，在Lm作为疫苗载体的研究中值得借鉴。另外，减毒微生物疫苗载体的安全性同样是细菌载体疫苗研究过程中不可忽视的因素。因此，对Lm毒力基因进行深入探讨，寻找最佳的减毒靶标基因，提高其使用安全性同样是未来研究的主攻方向。相信随着对Lm毒力基因和跨膜转运机制认识的深入，不断会有高效递呈疫苗的新策略出现并极大促进Lm作为疫苗载体研究的发展。

图3　细菌表面展示技术锚定系统Fig.3　Bacterial surface display system

参考文献：

[1]Lecuit M,Cossart P.Genetically-modified-animal models for human infections:the Listeria paradigm[J].Trends Mol Med,2002,8:537-542.

[2]Glaser P,Frangeul L,Buchrieser C,etal.Comparative genomics of Listeria species[J].Science,2001,294:849-852.

[3]Vázquez-Boland JA,Kuhn M,Berche P,etal.Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants[J].Clin Microbiol Rev,2001,14:584-640.

[4]Liang ZZ,Sherrid AM,Wallecha A,etal.Listeria monocytogenes:A promising vehicle for neonatal vaccination[J].Hum Vaccin Immunother,2014,10:1036-1046.

[5]Miller EA,Spadaccia MR,Norton T,etal.Attenuated listeria monocytogenes vectors overcome suppressive plasma factors during HIV infection to stimulate myeloid dendritic cells to promote adaptive immunity and reactivation of latent virus[J].AIDS Res Hum Retroviruses,2015,31(1):127-136.

[6]Cory L,Chu C.ADXS-HPV:A therapeutic Listeria vaccination targeting cervical cancers expressing the HPV E7 antigen[J].Hum Vaccin Immunother,2014,10(11):3190-3195.

[7]Quispe-Tintaya W,Chandra D,Jahangir A,etal.Nontoxic radioactive Listeriaat is a highly effective therapy against metastatic pancreatic cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110:8668-8673.

[8]Bertrand Toussaint,Xavier Chauchet,Yan Wang,etal.Live-attenuated bacteria as a cancer vaccine vector[J].Expert Rev Vaccines,2013,12(10):1139-1154.

[9]Bruhn KW,Craft N,Miller JF.Listeria as a vaccine vector[J].Microbes Infect,2007,9(10):1226-1235.

[10]Wolff JA,Malone RW.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo[J].Science,1990,247(4949):1465-1468.

[11]Coley WB.The treatment of malignat tumors by repeated inoculations of erysipelas:with a report of ten original cases[J].Clin Orthop Relat Res,1893,105(5)：487-510.

[12]Cummins J,Tangney M.Bacteria and tumours:causative agents or opportunistic inhabitants?[J].Infect Agent Cancer,2013,8:11.

[13]Toussaint B,Chauchet X,Wang Y,etal.Live-attenuated bacteria as a cancer vaccine vector[J].Expert Rev Vaccines,2013：1139-1154.

[14]VazquezBoland JA,Kuhn M,Berche P,etal.Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants[J].Clin Microbiol Rev,2001,14(3):584-640.

[15]Steffen Jung,Derya Unutmaz,Phillip Wong,etal.In vivo depletion of CD11c+dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens[J].Immunity,2002,17:211-220.

[16]Yin Y,Tian D,Jiao H,etal.Pathogenicity and immunogenicity of a mutant strain of Listeria monocytogenes in the chicken infection model[J].Clin Vaccine Immunol,2011,18(3):500-505.

[17]Loeffler DI,Schoen CU,Goebel W,etal.Comparison of different live vaccine strategies in vivo for delivery of protein antigen or antigen-encoding DNA and mRNA by virulence-attenuated Listeria monocytogenes[J].Infect Immun,2006,74(7):3946-3957.

[18]Whitney JB,Mirshahidi S,Lim SY,etal.Prior exposure to an attenuated Listeria vaccine does not reduce immunogenicity:pre-clinical assessment of the efficacy of a Listeria vaccine in the induction of immune responses against HIV[J].J Immun Based Ther Vaccines,2011,9(1):1-7.

[19]Hassan Momtaz,Shole Yadollahi.Molecular characterization of Listeria monocytogenes isolated from fresh seafood samples in Iran[J].Diagn Pathol,2013,8(1):149.

[20]Dietrich G,Kolb-Mäurer A,Spreng S,etal.Gram-positive and Gram-negative bacteria as carrier systems for DNA vaccines[J].Vaccine,2001,19(17-19):2506-2512.

[21]Horne MT.Technical aspects of the administration of vaccines[J].Dev Biol Stand,1997,90:79-89.

[22]Menudier A,Rougier F,Bosgiraud C.Comparative virulence between different strains of Listeria in zebrafish (Brachydanio rerio) and mice[J].Pathol Biol (Paris),1996,44(9):783-789.

[23]Jeyasekaran G,Karunasagar I,Karunasagar I.Incidence of Listeria spp.in tropical fish[J].Int J Food Microbiol,1996,31(1-3):333-340.

[24]Shata MT,Stevceva L,Agwale S,etal.Recent advances with recombinant bacterial vaccine vectors[J].Mol Med Tod,2000(6):66-71.

[25]Frey J.Biological safety concepts of genetically modified live bacterial vaccines[J].Vaccine,2007，25:5598-5605.

[26]Kim K,Jeong JH,Lim D,etal.A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS[J].PloS one,2013,8:e60511.

[27]Thompson RJ,Bouwer HA,Portnoy DA,etal.Pathogenicity and immunogenicity of a listeria monocytogenes strain that requiresd-alanine for growth[J].Infect Immun,1998,66 (8):3552-3561.

[28]Sciaranghella G,Lakhashe S K,Ayash-Rashkovsky M,etal.A live attenuated Listeria monocytogenes vaccine vector expressing SIV Gag is safe and immunogenic in macaques and can be administered repeatedly[J].Vaccine,2011,29 (3):476-486.

[29]Xin W,Wanda SY,Zhang X,etal.The Asd+-DadB+dual-plasmid system offers a novel means to deliver multiple protective antigens by a recombinant attenuated Salmonella vaccine[J].Infect Immun,2012,80 (10):3621-3633.

[30]Borsuk S,Mendum TA,Fagundes MQ,etal.Auxotrophic complementation as a selectable marker for stable expression of foreign antigens in Mycobacterium bovis BCG[J].Tuberculosis (Edinb),2007,87:474-480.

[31]Vidal L,Pinsach J,Striedner G,etal.Development of an antibiotic-free plasmid selection system based on glycine auxotrophy for recombinant protein overproduction in Escherichia coli[J].J Biotechnol,2008,134:127-136.

[32]Yan Y,Mu W,Zhang L,etal.Asd-based balanced-lethal system in attenuated Edwardsiella tarda to express a heterologous antigen for a multivalent bacterial vaccine[J].Fish Shellfish Immunol,2013,34 (5):1188-1194.

[33]uhlén SS.Bacterial surface display:trends and progress[J].Trends Biotechnol,1997,15 (5):185-192.

[34]Zhang J,De Masi L,John B,etal.Improved delivery of the OVA-CD4 peptide to T helper cells by polymeric surface display on Salmonella[J].Microb Cell Fact,2014,13:80.

[35]Sun H,Wang L,Wang T,etal.Display of Eimeria tenella EtMic2 protein on the surface of Saccharomyces cerevisiae as a potential oral vaccine against chicken coccidiosis[J].Vaccine,2014,32 (16):1869-1876.

[36]Wang X,Chen W,Tian Y,etal.Surface display of Clonorchis sinensis enolase on Bacillus subtilis spores potentializes an oral vaccine candidate[J].Vaccine,2014,32 (12):1338-1345.

[37]Lee SY,Choi JH,Xu Z.Microbial cell-surface display[J].Trends in biotechnology,2003,21 (1):45-52.

[38]Schneewind O,Missiakas DM.Protein secretion and surface display in Gram-positive bacteria[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2012,367 (1592):1123-1139.

[39]Guan L,Mu W,Champeimont J,etal.Iron-regulated lysis of recombinant Escherichia coli in host releases protective antigen and confers biological containment[J].Infect Immun,2011,79:2608-2618.

[收稿2015-06-25修回2015-07-13]

(编辑张晓舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.028

作者简介：丁承超(1992年-)，男，硕士，主要从事病原微生物疫苗研究，E-mail:ding10118026@163.com。 通讯作者及指导教师：刘箐(1970年-)，男，博士，教授，主要从事食源性致病菌致病机理及控制研究研究，E-mail:liuq@usst.edu.cn。

中图分类号R392.9

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0892-04

①本文受国家自然科学基金(No. 31371776)和上海市科委重点支撑项目(No.13430502400)资助。