ANCA阴性少免疫沉积型新月体性肾炎患者血清AECA与临床表现的关系研究

董向楠　曹　锐　尹良红

(暨南大学附属第一医院,广州510632)

ANCA阴性少免疫沉积型新月体性肾炎患者血清AECA与临床表现的关系研究

董向楠曹锐尹良红

(暨南大学附属第一医院,广州510632)

[摘要]目的：探讨抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)阴性少免疫沉积型新月体性肾炎患者血清抗内皮细胞抗体(AECA)表达情况，及其与临床表现的关系。方法：选取2010年至2015年在我院治疗的少免疫沉积型新月体性肾小球肾炎患者，其中ANCA阴性患者45例(观察组)，ANCA阳性患者49例(对照组)，采用Western blot检测各组患者血清AECA水平。结果：观察组平均年龄和伯明翰血管炎活动性评分(BVAS)分别为(41.08±9.43)岁和(15.03±3.82)分，明显低于对照组(P<0.05)；观察组出现发热、关节痛的比例分别为26.67%和13.33%，明显低于对照组(P<0.05)；观察组出现肾病综合征比例为48.89%，高于对照组(P<0.05)；观察组血清AECA阳性率为46.67%，明显低于对照组的81.63%(P<0.05)；观察组IgG-AECA共识别7种蛋白，而对照组共识别11种蛋白，其中观察组抗90 kD抗体阳性率为13.33%(6/45)，明显低于对照组的51.02%(25/49)(P<0.05)；观察组抗76 kD抗体阳性患者出现皮疹的比例为100%，明显高于阴性患者(P<0.05)，抗200 kD抗体阳性患者BVAS评分为(18.02±2.51)分，明显高于阴性患者(P<0.05)。结论：ANCA阴性少免疫沉积型新月体性肾炎患者血清存在不同的AECA,可能与某些临床表现有关；ANCA阴性和阳性患者AECA有所不同，两者临床表现的差异可能与AECA的不同有关，需待进一步研究。

[关键词]ANCN；AECA；少免疫沉积型；新月体肾炎

少免疫沉积型新月体肾炎(PICGN)是新月体肾小球肾炎(CGN)的一种，是一组以血尿、蛋白尿和进行性肾功能减退为主要特征的临床综合征[1]。目前研究主要集中在血清中抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)呈阳性的患者，但是部分PICGN患者血清ANCA呈阴性,对于这部分病例的研究较少。经研究表明抗内皮细胞抗体(AECA)在阳性PICGN发病中起到重要作用[2，3]，因此笔者推测AECA在阴性PICGN发病中也会起到一定作用。为研究AECA与阴性PICGN的关系，本次实验就抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)阴性少免疫沉积型新月体性肾炎患者血清抗内皮细胞抗体(AECA)表达情况，及其与临床表现的关系进行探讨。

1资料与方法

1.1一般资料选取2010年至2015年在我院治疗的少免疫沉积型新月体性肾小球肾炎患者，纳入标准：①符合新月体性肾小球肾炎的诊断标准，即肾活检光镜检查超过50%的肾小球有大新月体(新月体占肾小球囊腔≥50%)形成；②肾脏直接免疫荧光病理中IgG、IgA和IgM荧光强度≤1+(0～4+分级)；③临床病理资料保存完整；④患者知情同意，并签署同意书。排除标准:研究开始前已行免疫抑制治疗；临床病理治疗欠缺。本次研究共纳入患者84例，其中抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)阴性患者35例(观察组)，ANCA阳性患者49例(对照组)。

1.2方法

1.2.1ANCA检测84例患者于空腹状态下抽取3 ml静脉血，静置后以3 000 r/min 离心3 min取血清。采用间接免疫荧光法(IF)和 MPO、PR3 抗原特异性 ELISA 法同时检测ANCA，试剂盒购自德国EUROIMMUN 公司。

1.2.2AECA检测

1.2.2.1蛋白样品收集所有患者于清晨空腹状态下抽取静脉血，离心制备血清，脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外培养后[4]，加1 ml的裂解液，匀浆后12 000 r/min离心，4℃，40 min，倾倒上清液，加入0.5 ml loading buffer，直接上样，分别加入标准品8 μl,抗原液400 μl。

1.2.2.2电泳所有蛋白样品调至等浓度后上样电泳(10%SDS-PAGE凝胶)，电压120 V，进行2 h。

1.2.2.3转膜将NC膜放入2%脱脂奶粉的TTBS按比例稀释的待测血清中，4℃下过夜。

1.2.2.4封闭及杂交将膜取出,用去离子水与TTBS稍加漂洗，在含封闭液与抗体溶剂中室温封闭1.5 h，加入按1∶6 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG溶液，室温下1 h。再用TTBS漂洗膜后再浸洗3次。

1.2.2.5发光鉴定ECL化学发光法显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集[5]。

2结果

2.1两组临床表现比较观察组和对照组在性别、病程、血肌酐以及皮疹、乏力、消化系统症状等比较差异无统计学意义(P>0.05)；观察组平均年龄和BVAS分别为(41.08±9.43)岁和(15.03±3.82)分，明显低于对照组，差异比较有统计学意义(P<0.05)；观察组出现发热、关节痛的比例分别为26.67%和13.33%，明显低于对照组，差异比较有统计学意义(P<0.05)；观察组出现肾病综合征比例为48.89%，高于对照组，差异比较有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2两组AECA阳性率比较观察组血清AECA阳性率为46.67%，明显低于对照组的81.63%，差异比较有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3两组血清IgG-AECA蛋白识别情况观察组IgG-AECA共识别7种不同的蛋白，分别为56、76、90、123、178和200 kD，而对照组IgG-AECA共识别11种不同的蛋白，分别为43、56、69、76、90、110、123、159、168、178和200 kD。见图1。观察组抗90 kD抗体阳性率为13.33%(6/45)，明显低于对照组的51.02%(25/49)，差异比较有统计学意义(χ2=14.158，P<0.05)；其他自身抗体比较差异无统计学意义(P>0.05)。

IndexObservation(n=45)Control(n=49)t/χ2PMale/Female26/1930/190.0130.910Age(year)41.08±9.4360.82±12.90-7.6970.000Durationofdisease(month)6.21±3.106.08±2.520.2120.843BVAS15.03±3.8221.26±4.57-6.5850.000Fever12(26.67)38(77.55)22.2600.000Arthralgin6(13.33)21(42.56)9.6470.002Erythra9(20.00)11(22.45)0.3560.551Feeble17(37.78)25(51.02)0.5450.460Nephroticsyndrome22(48.89)7(14.29)21.3080.000Symptomofdigestivesystem5(11.11)6(12.24)0.0750.785Scr(μmol/L)601.10±89.43642.08±96.83-1.9730.061

Note：BVAS is short for Birminham systemic vasculitis activity score.

表2两组血清AECA阳性率比较[n(%)]

Tab.2Comparison of AECA positive rate in two groups[n(%)]

GroupnAECApositiveχ2PObservation4521(46.67)11.8610.001Control4940(81.63)

图1　Western blot 检测图Fig.1　Western blot test chartNote: 1-6.Observation group；7-9.Control group；10.Blank control.

2.4观察组IgG-AECA蛋白与临床表现的关系观察组抗76 kD抗体阳性患者出现皮疹的比例为100%(5/5)，阴性患者出现皮疹的比例为2.5%(1/40)，差异比较有统计学意义(χ2=21.800，P<0.05)；抗200 kD抗体阳性患者BVAS评分为(18.02±2.51)分，阴性患者为(14.10±3.15)分，差异比较有统计学意义(t=2.855，P<0.05)。其他自身抗体与临床指标之间未发现相关性。

3讨论

新月体肾小球肾炎(CGN)是肾小球肾炎中最严重的一种类型，也是肾脏科常见的急危重症。少免疫沉积型(PICGN)是CGN的一种， PICGN是指无或仅有少量免疫复合物沉积于肾小球的CGN，通常认为PICGN是系统性小血管炎肾脏受累引起[5]。PICGN其主要的临床表现为水肿、蛋白尿、血尿和高血压等。并且PICGN多伴有肾外器官受累，如心肌缺血改变、心包炎和血管炎性皮疹等并发症[6]。经研究发现PICGN患者血清中抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)既有呈阳性又有呈阴性的，但对ANCA呈阴性患者研究较少。并且笔者发现ANCA 呈阳性或阴性的PICGN患者均可能与抗内皮细胞抗体(AECA)表达有关。

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是一种以单核细胞和中性粒细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体谱，主要包括髓过氧化物酶 (MPO)、蛋白酶3(PR3)、组织蛋白酶G(GG)、乳铁蛋白 (LF) 和溶菌酶(LYS)等[7]。研究显示ANCA与系统性血管炎的发生密切相关，而ANCA相关小血管炎常累及肾脏，典型的病理表现为PICGN，因此，ANCA在PICGN的发病中起到重要作用[8]。AECA是一组异质性抗体，可引起细胞损伤和诱导内皮细胞凋亡，主要存在于与血管炎有关的自身免疫性疾病，为血管受损和血管炎的标记[9]。此外，AECA本身具有致病性，研究显示，AECA与多种疾病的发生密切相关，如SLE、狼疮性肾炎、冠状动脉粥样硬化性心脏病、混合性结缔组织病和系统性血管炎等[10]，因此，血清AECA可以作为一种用于评估、诊断病情和判断预后的血清学指标，在自身免疫性血管炎致病过程中的作用越来越受到重视[11]。而关于ANCA阴性PICGN患者血清AECA与临床表现的关系目前尚无报道[12]，为研究AECA与阴性PICGN的临床表现的关系，本次实验就抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)阴性少免疫沉积型新月体性肾炎患者血清抗内皮细胞抗体(AECA)表达情况，及其与临床表现的关系进行探讨。

本次实验通过对ANCA阴性与ANCA阳性PICGN患者平均年龄和伯明翰血管炎活动性评分(BVAS)、临床表现及识别IgG-AECA种类进行比较，结果发现ANCA阴性患者与ANCA阳性PICGN患者在以上各个方面存在显著性差异(P<0.05)。ANCA阴性PICGN患者血清中识别出7种不同AECA。说明PICGN患者ANCA阴性时可以检测到AECA，AECA可能与PICGN疾病的活动性有关，但具体关系不明。并且ANCA阴性与ANCA阳性PICGN患者识别的IgG-AECA种类不同，临床表现也存在差异，说明两者临床表现的差异可能与AECA的不同有关，但具体关系不明。

综上所述，我们认为ANCA阴性少免疫沉积型新月体性肾炎患者血清存在不同的AECA，可能与某些临床表现有关；ANCA阴性和阳性患者AECA有所不同，两者临床表现的差异可能与AECA的不同有关，由于本研究选取的样本量较小，具体关系还需近一步的深入研究。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-26]

(编辑倪鹏)

Relationship between serum AECA and clinical signatures of ANCA negative pauci-immune deposition type crescentic glomerulonephritis patients

DONG Xiang-Nan,CAO Rui,YIN Liang-Hong.

The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou,510632，China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of anti-endothelial cell antibodies(AECA) in patients serum with anti-neutrophil cytoplasmic antibody(ANCA) negative pauci-immune deposition type crescentic glomerulonephritis and its relationship with clinical signatures.Methods: We selected 94 pauci-immune deposition type crescentic glomerulonephritis patients from 2010 to 2015 treated in our hospital,45 of which with ANCA-negative(observation group) and 49 cases of ANCA-positive patients (control group),AECA levels of each groups serum were detected by Western blot test.Results: The average age of the observation group and Bermingham vasculitis activity score(BVAS) respectively (41.08 + 9.43) years old and (15.03 + 3.82),significantly lower than the control group (P<0.05);the observation group had fever,joint pain accounted for 26.67% and 13.33%,significantly lower than the control group (P<0.05);the observation group of nephrotic syndrome accounted for 48.89%,higher than the control group (P<0.05);observation group positive rate of serum AECA was 46.67%,significantly lower than the control group 81.63% (P<0.05);the observation group IgG-AECA identified 7 proteins,while the control group had identified 11 proteins,of which the observation group the positive rate of anti 90 kD antibody was 13.33%(6/45),significantly lower than the control group 51.02%(25/49) (P<0.05);observation group of anti 76 kD antibody positive patients had rash ratio of 100%,significantly higher than negative patients (P<0.05),anti 200 kD antibody positive the BVAS score of the patients was (18.02 + 2.51),which was significantly higher than that of the negative patients (P<0.05).Conclusion: The different level of AECA in ANCA negative pauci-immune crescentic glomerulonephritis patients may be associated with certain clinical manifestations;clinical manifestations differences between the ANCA negative and positive patients may be associated with different expression of the AECA related,the detail need a further study.

[Key words]ANCA;AECA;Pauci-immune deposition type;Crescentic glomerulonephritis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.023

作者简介：董向楠(1984年-)，女，硕士，住院医师，主要从事肾脏病理学方面研究。

通讯作者及指导教师：尹良红(1961年-)，女，博士，主任医师，博士生导师，主要从事血液透析及其并发症的诊断方面研究。

中图分类号R593.2

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0875-04