小鼠ANA-1巨噬细胞不同极化状态下补体组分mRNA动态分析①

袁梦娇　商正玲　马亚萍　吴家红

(贵州医科大学基础医学院免疫学教研室，贵阳550025)

小鼠ANA-1巨噬细胞不同极化状态下补体组分mRNA动态分析①

袁梦娇商正玲马亚萍吴家红②

(贵州医科大学基础医学院免疫学教研室，贵阳550025)

[摘要]目的：观察小鼠ANA-1巨噬细胞不同极化状态下补体相关组分的mRNA动态变化。方法：分别以LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)体外刺激小鼠ANA-1细胞，于刺激后3、8、12及24 h时间点收获细胞，Trizol法提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR法检测IL-1β、CCL2、Arg-1的表达，判断细胞极化情况，检测胞内C3、CfB、CRIg、C1q补体分子mRNA的动态表达。结果：细胞极化情况：刺激3 h后LPS组IL-1β、CCL2 的mRNA表达上调，12 h达高峰(2-△△Ct分别为297.0±31.0和19.9±3.3)；在IL-4组中以Arg-1mRNA表达上调显著，于24 h达高峰(2-△△Ct：27.3±9.1)，提示LPS组细胞向M1方向极化，IL-4组向M2方向极化。细胞内补体mRNA的动态：两极化组的相应补体组分均表现为不同程度的上调，其中：C1q、C3在M2极化组刺激8 h后显著上调，刺激12 h时达高峰(2-△△Ct分别为94.9±12.9和11.3±2.4)；CfB因子在M1极化组中显著上调，以刺激12 h表达上调达高峰(2-△△Ct为61.4±6.2)；CRIg在两组中均在24 h时表达上调且具有显著性差异(P<0.05)。结论：LPS/IL-4刺激3 h后，ANA-1细胞分别向M1、M2方向极化；不同补体组分mRNA的表达在两组中均上调但表达谱不同，其中C1q、C3和CRIg在M2极化组中上调更为显著，而CfB因子在M1极化组中显著上调；除CRIg外，C1q、C3及CfB因子均在刺激12 h时上调达高峰，上述结果提示补体组分的变化可能与极化的巨噬细胞功能有关。

[关键词]ANA-1；巨噬细胞极化；补体组分mRNA

在脊椎动物体内补体系统由30多种蛋白组成，通常以无活性的形式广泛存在于血液、组织液和细胞膜表面，是机体固有免疫的重要组成成分[1]。除血液中的补体成分主要由肝细胞合成分泌外，机体局部组织中的肝外补体主要来自活化的巨噬细胞。近年来，不同微环境造成巨噬细胞的极化而导致不同的免疫结局成为研究的热点问题。Th1型细胞因子(如IFN-γ)、TLR配体(如LPS)和一些危险信号可刺激巨噬细胞向M1方向极化，导致IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL2、活性氮和氧中间体的分泌释放增多，MHCⅠ和MHCⅡ的表达增高，细胞具有较强的促炎作用、抗原提呈能力和杀微生物的特点。而IL-4、IL-13等Th2型细胞因子，可刺激巨噬细胞向M2方向极化，细胞以IL-10、Arg-1高表达和IL-12低表达为特征，参与抗寄生虫免疫、局部组织修复，炎症抑制等作用[2]。

巨噬细胞和补体系统同属机体固有免疫的重要代表，然而人们对不同极化状态下的巨噬细胞表达补体的差异及规律认识不足[3]，故本研究以LPS和IL-4分别刺激小鼠巨噬细胞ANA-1建立细胞极化模型后，检测细胞内不同补体成分mRNA的变化，为探究不同极化状态的巨噬细胞表达补体组分的差异和规律提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂RPMI1640培养基、100 U/ml青-链霉素、胰蛋白酶(HyClone公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)；逆转录试剂盒、SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa Biotechnology公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；IL-4(eBioscience 公司)；LPS(Sigma公司)。

1.1.2细胞ANA-1细胞系来源于C57BL/6小鼠的骨髓单核巨噬细胞[4]，为四川大学鲍郎教授惠赠。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养小鼠巨噬细胞ANA-1用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，2～3 d传代一次，取对数生长期细胞用于实验；

1.2.2LPS/IL-4刺激ANA-1细胞ANA-1细胞以106个/孔接种于6孔培养板内，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养24 h 后，将LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)分别添加到ANA-1细胞培养基中。以添加等量PBS的细胞组作为空白对照。于刺激3、8、12、24 h后，PBS洗2次，收集细胞。

1.2.3Trizol法提取细胞总RNA并逆转录收集细胞后用Trizol法提取总RNA：加入Trizol裂解液1 ml裂解细胞15 min后，加入氯仿200 μl，剧烈震荡15 s，离心12 000 r/min，4℃，15 min。吸取上层水相，转入新的1.5 ml Ep管，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置1 h后离心12 000 r/min，4℃，10 min。弃上清，加入75%乙醇(以DEPC水配制)1 ml洗涤，7 500 r/min，5 min，4℃离心，弃上清，室温干燥后溶于20 μl DEPC水中并定量。根据逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，-20℃保存。之后用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)法检测相关基因的表达。

1.2.4Real-Time PCR法检测相关基因mRNA的表达采用SYBR-Green染料法检测LPS/IL-4刺激细胞后各基因的表达水平。引物在上海捷瑞有限公司合成。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，退火31 s，40个循环。以GAPDH为内参基因。目的基因mRNA表达水平采用2-△△Ct公式计算。判断依据：2-△△Ct>2认为基因表达增高，2-△△Ct<0.5认为基因表达下调。引物序列见表1。

表1Real-Time PCR引物序列

Tab.1Sequence of Real-Time PCR primers

Forwardsequence(5'-3')Reversesequence(5'-3')ProductsizeIL-1βTGTGAAATGCCACCTTTTGATGTCCTCATCCTGGAAGGTC240CCL2TTAAGGCATCACAGTCCGAGTGAATGTGAAGTTGACCCGT129Arg-1CAGAAGAATGGAAGAGTCAGCAGATATGCAGGGAGTCACC249C3GCAGGTCATCAAGTCGGCTTAGCTGGTGTTGGGCTTTTC162CRIgGGACGAAGAGACCTGTTGTAGATGAGTGTTCGGACGC278CfBCTCGAACCTGCAGATCCACTCAAAGTCCTGCGGTCGT112C1qTAGAAGCATCACAGAACATAGAAGCAGCAGTAACAG108

2结果

2.1LPS/IL-4刺激后 ANA-1细胞的极化结果显示：各检测时间点PBS对照组胞内IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA的表达稳定(图1)。而LPS刺激组3 h后IL-1β mRNA表达明显增高，12 h达高峰(2-△△Ct值达297.0±31.0)，24 h仍可维持较高水平(2-△△Ct值达64.0±13.1)；CCL2 mRNA也表现为相似的动态，于12 h达高峰(2-△△Ct值达19.9±3.3)。但Arg-1 mRNA的表达以IL-4组显著增加，于24 h达高峰(2-△△Ct值达27.3±9.1)，而在LPS组中表达不明显。上述结果表明LPS刺激组ANA-1细胞向M1方向极化，而IL-4刺激组细胞向M2方向极化(图2)。

2.2不同时间点PBS组胞内各补体成分mRNA的动态结果显示：各检测时间点内PBS对照组细胞内补体C1q、C3、CfB、CRIg mRNA动态均无显著性差异(图3)。

2.3不同极化状态下胞内补体C1q mRNA的动态结果显示： M2组(IL-4刺激组)C1q mRNA水平在8 h后显著高于LPS组， 12 h时达高峰(2-△△Ct值为94.9±12.9)，24 h时下降(2-△△Ct值为4.1±4.0)。而在M1组(LPS刺激组)中C1q mRNA波动不明显，仅在12 h瞬时上调(2-△△Ct值为5.3±0.7)(图4A)。

2.4不同极化状态下胞内补体CfB mRNA的动态结果显示： M2组3 h CfB表达开始上调，以8 h上调达高峰(2-△△Ct值为4.75±1.43)。M1组在刺激8 h时表达上调(2-△△Ct值可达14.4±1.4)，以12 h达高峰(2-△△Ct值可达61.4±6.2)，24 h后表达减弱(2-△△Ct值达8.6±2.3)。CfB基因表达以M1组上调差异显著(图4B)。

图1　PBS作用ANA-1细胞后胞内IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA的表达Fig.1　Expression of IL-1β,CCL2，Arginase-1 mRNA in ANA-1 cells treated with PBS

图2　LPS/IL-4刺激ANA-1细胞后胞内IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA相对表达量(2-△△Ct)Fig.2　Relative expression of IL-1β,CCL2，Arge-1 mRNA in ANA-1 cells treated with LPS and IL-4，respectively(2-△△Ct)Note: The 2-△△Ct of LPS groups compared with IL-4 groups，**.P<0.01；***.P<0.001.

图3　PBS作用ANA-1细胞后胞内C1q、CfB、CRIg、C3 mRNA的表达Fig.3　Expression of C1q，CfB，CRIg，C3 mRNA in ANA-1 cells treated with PBS

图4　LPS/IL-4刺激ANA-1细胞后胞内C1q、CfB、CRIg、C3相对表达量(2-△△Ct)Fig.4　Relative expression of C1q，CfB，CRIg，C3 mRNA in ANA-1 cells treated with LPS and IL-4，respectively(2-△△Ct)Note: The 2-△△Ct of LPS groups compared with IL-4 groups，*.P<0.05；***.P<0.001.

2.5不同极化状态下胞内补体CRIg mRNA的动态结果显示：刺激24 h时两组中该基因表达均上调，其中M1组2-△△Ct值达6.5±1.8，M2组为10.8±3.2，两组间具有显著性差异(P<0.05)，见图4C。

2.6不同极化状态下胞内补体C3 mRNA的动态结果显示：不同检测时间点M2组均较M1组表达明显增高，8 h时2-△△Ct值达8.0±1.2，12 h时达高峰(11.3±2.4)，24 h后下降(7.9±1.3)。M1组中该基因波动不明显，仅在8～12 h间轻微上调,见图4D。

3讨论

补体是生物体早期进化的免疫成分之一，在海胆、文昌鱼、七鳃鳗和盲鳗等无脊椎动物体内均有发现[5]。在补体系统中C1q是参与补体经典激活途径的第一个成员，MBL是补体MBL途径的成员代表，CfB因子是补体旁路途径活化的首要成分之一，而C3是补体系统激活的枢纽成分。补体被激活后参与炎症、组织器官发育、肿瘤等许多病理生理过程[6]。

巨噬细胞具有极大的可塑性，M1极化的细胞具有较强的抗原提呈和杀微生物的特点及促炎作用，但过度M1极化会导致炎症失控，造成组织损伤。而M2极化的细胞能促组织修复，抑制炎症，维持局域组织稳态，成为持续性感染的原因之一[7]。组织中定居的巨噬细胞合成分泌补体，是局域免疫的重要成分。本实验用LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)分别刺激小鼠ANA-1巨噬细胞建立极化模型，探讨不同极化的巨噬细胞胞内补体组分mRNA的动态变化。结果显示：刺激3 h后LPS组IL-1β、CCL2的表达较IL-4组有明显增加，说明巨噬细胞向M1方向极化。而受IL-4刺激后细胞Arg-1基因高表达，提示其向M2方向极化。

在此极化模型基础上，我们首先检测PBS对照组中胞内补体组分mRNA的动态，发现不同时间点补体表达变化不明显(图3)。通过对不同极化巨噬细胞的C1q、CfB、C3及CRIg mRNA的2-△△Ct值分析发现，胞内补体成分在两组中均有不同程度的上调：CfB在M1组中显著上调，而C3、C1q及CRIg在M2组中显著上调；此外，除CRIg外，各组C1q、CfB及C3的表达均表现相似的时间动态，在12 h出现高峰表达，24 h表达逐渐降低。

C1q是最早被发现的补体成分，巨噬细胞是其产生的主要来源[8]。近年来C1q作为一种模式识别受体(PRR)越来越受到关注，与C-反应蛋白、低密度脂蛋白、PTX3以及多种PAMP/DAMP配体结合后参与补体激活、凋亡细胞清除等过程。研究显示，C1q与受体(如C1qR、清道夫受体、甘露糖受体等)结合后，能增强巨噬细胞的吞噬功能，导致IL-10、IL-27上调，抑制IL-1β的表达，参与局域组织修复及稳态的功能[9]。C1q可抑制摄取oxLDL的Raw264.7巨噬细胞中NF-κB通路，使IL-1β、IL-6表达下降，而IL-10增加[10]。本研究数据提示IL-4刺激后向M2极化的小鼠ANA-1巨噬细胞株也出现C1q mRNA的显著上调，提示该补体组分参与M2型巨噬细胞的生物学效应。

CfB是启动补体旁路途径活化的关键过程[11]。本研究结果显示M1巨噬细胞在刺激12 h后B因子的mRNA水平达高峰(2-△△Ct：61.4±6.2)，而在M2组中变化不明显，提示CfB因子与M1型巨噬细胞功能有关联。临床资料显示脓毒血症患者体内CfB的表达明显增加，腹水和血清中Ba和C3片段显著增加。在小鼠的败血症模型中发现敲除TLR4(LPS的受体)后CfB表达降低，表明CfB是LPS-TRL4信号通路的下游靶基因[12，13]。

CRIg是仅表达于组织中巨噬细胞的一类补体受体。与配体结合后，可增强巨噬细胞对病原体的识别和吞噬能力，参与病原体和凋亡细胞的清除[14]。本实验结果显示：在刺激24 h后两组细胞内CRIg mRNA才显著上调，滞后于其他补体成分，若需观察该成分的动态还需延长检测时间。

C3是补体活化的枢纽成分，C3a与C3aR结合后激活ERK1/2信号通路，促进胞内ATP的释放，诱导NLRP3炎症小体活化，IL-1β的成熟和释放，参与清除循环免疫复合物、降低B细胞活化阈值、调理吞噬、调节Th细胞分化等多种效应[15-17]。已有研究证实M1极化时巨噬细胞中C3aR1的表达上调而在M2细胞中下调，均提示C3参与不同极化细胞的功能[17]。本实验结果显示：M2极化组C3 mRNA表达较M1组明显，但相对其他补体组分而言，C3在胞内变化幅度较低，这可能与C3基因本身在细胞中表达的基值较高有关。

巨噬细胞向M1和M2极化不仅是一个动态可逆的过程[2]，研究显示补体的不同成分对细胞的极化调控不同，如C1q、C3b有助于细胞向M2方向分化，而C3a、C5a及C5b-9驱动细胞向M1方向极化[9，18]。而本实验探讨在细胞极化后补体不同组分的mRNA动态，为说明补体与巨噬细胞功能变化的内在关联提供了一定的实验依据。

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[收稿2015-12-15修回2016-03-18]

(编辑倪鹏)

Dynamic characteristics of intracellular complement components mRNA in different mouse macrophage ANA-1 polarization

YUAN Meng-Jiao，SHANG Zheng-Ling，MA Ya-Ping，WU Jia-Hong.

The Department of Immunology,Basic Medical School,Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China

[Abstract]Objective:To reveal the dynamic characteristics of the intracellular complement mRNA from mouse macrophage ANA-1 treated with LPS or IL-4.Methods: The polarization models of macrophage ANA-1 were established by treating with LPS(1 μg/ml) and IL-4(20 ng/ml),respectively.After treating at 3,8,12 and 24 h,the total RNA were abstracted by Trizol lysis methods .The macrophage polarization were estimated by the expression of IL-1β,CCL2 and Arg-1 mRNA detected by Real-time fluorescent quantitative PCR.The intracellular complement C1q,C3,CfB and CRIg mRNA were quantitatively analyzed.Results: The mouse macrophage ANA-1 cells treated with LPS was polarized to M1 since the levels of IL-1β and CCL2 mRNA were up-regulated significantly,in which their 2-△△Ctvalue were up to 297.0±31.0 and 19.9±3.3 respectively at 12 h.On the other hand,the ANA-1 cells treated with IL-4 was polarized to M2 because the level of Arg-1 mRNA was obviously higher(the 2-△△Ctvalue of Arg-1 mRNA was up to 27.3±9.1 at 24 h)(P<0.05).The intracellular complement C1q,C3,CfB and CRIg mRNAs all were up-regulated in different polarized macrophages.The intracellular C1q and C3 mRNA in polarized M2 were significantly higher,in which the peak value of C1q and C3 were to 94.9±12.9 and 11.3±2.4 at 12 h，respectively(P<0.05).Reversely,the CfB mRNA in polarized M1 increased obviously,in which its 2-△△Ctwas to 61.4±6.2 at 12 h.In addition,the CRIg mRNA in both groups was only up-regulated at 24 h,in which the 2-△△Ctvalue was 6.5±1.8 in M1 and 10.8±3.2 in M2(P<0.05).Conclusion: The macrophage ANA-1 cell polarization models were successfully established by treated with LPS or IL-4.The intracellular complement C1q,C3 and CRIg mRNA in polarized M2 were transcripted more than in M1.But the intracellular CfB mRNA in polarized M1 was up-regulated significantly.These results suggested that the dynamic characteristic of complement components in different polarized macrophage would be correlated with its funtions.

[Key words]ANA-1;Macrophage polarization;Complement component mRNA

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.003

作者简介：袁梦娇(1989年- ),女,医学硕士,主要从事抗感染免疫方面的研究,E-mail:myyuanmengjiao@163.com。 通讯作者及指导教师：商正玲(1974年-),女,医学博士,副教授,硕士生导师,主要从事抗感染免疫方面的研究，E-mail:shangzhengling@126.com。

中图分类号R392.1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0782-05

①本文受贵州省社会发展合作专项资金项目(黔科合[2010]3155)和贵州省科学技术基金(黔科合J字[2008]2156号)资助。

②贵州医科大学基础医学院病原生物学实验室，贵阳550025。