颅脑损伤后大鼠脑皮质中神经丝的改变 Calpain活性的变化及两者之间的关系研究

王远传　张　涛　印晓鸿　赵　龙　段军伟　李　舜　杨彬彬　旷仁钊

川北医学院附属医院神经外科　南充　637000

颅脑损伤后大鼠脑皮质中神经丝的改变 Calpain活性的变化及两者之间的关系研究

王远传张涛印晓鸿赵龙段军伟李舜杨彬彬旷仁钊

川北医学院附属医院神经外科南充637000

【摘要】目的观察颅脑损伤后大鼠脑皮质中神经丝的改变，同时检测Calpain活性的变化，探讨两者之间的关系及其对治疗颅脑损伤的意义。方法25只雄性Wistar大鼠，随机分为正常对照组、颅脑损伤组(颅脑损伤后6 h、12 h、24 h、72 h)共5 组，每组5只。采用Myneurolab脑立体定向仪和Benchmark颅脑损伤撞击器制作创伤性颅脑损伤模型。应用免疫组化法检测上述时间点损伤灶周围皮层中神经丝的形态改变，检测Calpain活性的变化。结果颅脑损伤后，神经丝的结构紊乱，降解逐渐增多，伤后24 h时降解达到最高点，随后降解的神经丝逐渐减少。颅脑损伤后Calipain活性随时间逐渐升高，伤后24 h时活性达到最高点，随后逐渐降低。结论颅脑损伤后神经丝降解的机制可能与Calipain活性的变化有关。

【关键词】颅脑损伤；神经丝；Calpain；活性改变

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)在全世界范围内都是一个严重的社会、医学问题，具有发病率、致残率、病死率高的特点，占全身创伤发生率第2位，病死率为第1位，是儿童及青壮年人主要的死亡和致残原因。本实验采用Myneurolab脑立体定向仪和Benchmark颅脑损伤撞击器制作大鼠颅脑损伤模型，采用分子生物学、免疫组织化学等方法，在观察颅脑损伤后神经丝的改变并测定Calpain的活性，探讨二者在颅脑损伤后随时间变化的规律，以探讨两者之间的关联，从而为颅脑损伤的治疗开辟新的思路。

1材料与方法

1.1实验材料实验动物与分组：健康雄性Wistar大鼠25只，SPF级，体质量(200±20)g，动物质量合格证号为SCXK(鄂)2012-0014，由我院实验动物中心提供。实验期间饲养于我院实验动物中心[环境许可证号SYXK(鄂)2004-0027，室温(25±2)℃，湿度60%～80%]，常规饮食，大鼠适应性喂养3 d后使用。实验动物按随机原则分为正常对照组、颅脑损伤组(6 h、12 h、24 h、72 h组)，每组5只。

主要试剂：NF-H/L鼠抗人多克隆抗体(Santa Cruz，sc-56575)，Santa Cruz公司；Calpain Activity Assay Kit(BioVision，K240-100)，Santa Cruz公司；GAPDH，Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)；标记羊抗兔二抗，Santa Cruz公司；重组人促红细胞生成素，沈阳三生；水合氯醛，国药集团(上海)；多聚甲醛，国药集团(上海)；骨蜡，上海三友外科器械有限公司；吸收性明胶海绵，金陵药业股份有限公司；DAB显色试剂盒，武汉博士德；SP 试剂盒，武汉博士德；10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺，武汉博士德；PBS磷酸盐缓冲溶液(0.01 M，pH 7.2～7.4)自配；多去污裂解缓冲液，上海碧云天；考马斯亮蓝，上海碧云天；中性树胶，上海标本模型厂；其余常规试剂均为国产分析纯。

1.2实验方法创伤性脑损伤模型的建立：术前准备：将实验大鼠适应性喂养3 d[室温(25±2)℃，湿度60%～80%]；称重：取小鼠放入称重桶内动态称重，并记录。麻醉：用新鲜配制10%水合氯醛(4 mL/kg体质量)，腹腔注射麻醉，同时观察小鼠状态，起初小鼠自主活动，随后异常兴奋，不安且四处转动，继而又由兴奋逐渐转为抑制，活动迟缓，倒下不动，呼吸减慢，带呼吸开始平稳，即为麻醉最佳状态；除毛备皮：剃毛器剃除小鼠头顶部鼠毛，用湿纱布擦拭后，准备手术；颅脑损伤组使用BenchmarkTM电磁颅脑损伤撞击器撞击硬脑膜(撞击速度4 m/s，撞击后探针停留时间约1 s，撞击面直径2.0 mm，深度约2.0 mm)，致右顶叶的脑挫裂伤；硬膜外使用明胶海绵止血，并用骨蜡封闭骨窗，全层缝合头皮；造模成功后分笼饲养小鼠，常规供给饲料和饮水。免疫组织化学检测：免疫组织化学染色严格按照SP试剂盒说明书操作。Calpain 活性检测：利用 BCA Protein Assay Kit 定量(操作步骤按说明书上进行)。分析并比较外伤组和对照组是否存在不同，以及各亚组随时间的变化趋势。

2结果

2.1NF-H/L的免疫组化结果光镜下观察示，神经丝蛋白NF-H/L在各脑组织切片上表达呈棕黄色，在脑皮质的大锥体细胞层、小锥体细胞层、海马区、胼胝体中表达尤为明显。神经丝蛋白NF-H/L在神经细胞的树突和轴突内均有表达，在大锥体细胞层中，大部分呈微细平行的丝状排列(图1、2)，少部分交织成网状。

2.1.1正常对照组NF-H/L的免疫组化结果：神经丝蛋白NF-H/L 在脑组织切片上含量丰富，呈棕黄色丝状结构，在脑皮质的大锥体细胞层、小锥体细胞层、海马区、胼胝体中表达尤为明显。神经丝蛋白NF-H/L在神经细胞的树突和轴突内均有表达，在大锥体细胞层中，大部分呈微细平行的丝状排列(图1)，少部分交织成网状。

2.1.2外伤组NF-H/L的免疫组化结果：颅脑损伤组与正常组相比，颅脑损伤后6 h见神经丝较正常组稀疏，部分结构中断，6～24 h内可见神经丝数目进一步减少，排列紊乱加重，至24 h破坏程度达到高峰，3 d时上述情况有所缓解(图2)。

图1　正常对照组NF-H/L的免疫组化结果(SP，×400)

6 h　　　　　　　　　　　　12 h

24 h　　　　　　　　　　　72 h

2.2Calpain活性测定结果Calpain活性在颅脑损伤后6 h较正常对照组组高(P<0.05)，并随时间变化逐渐升高，颅脑损伤后24 h达到活性达最高值(P<0.01)，随后逐渐降低，但仍然较对照组高。见表1。

表1　Calpain活性测定结果

3讨论

近年来，Calpain在颅脑损伤、脑缺血等疾病中的作用受到普遍关注，其生物学特性、可能的生理功能和病理生理的作用机制的研究日益受到国际学术界的广泛重视。无活性蛋白——Calpain被激活后，能使神经丝、髓磷脂、微管以及其他结构蛋白降解，导致神经元结构破坏[1]，在实验性颅脑损伤、脑缺血、脊髓损伤等神经元的退变过程中，细胞内钙离子内稳态的破坏引起钙超载。而细胞内钙超载是造成细胞不可逆性损伤的最终共同通路之一，是颅脑损伤、脑缺血等病变引发的继发性损伤的主要原因之一[2-3]。研究发现，Calpain的激活在加重脑缺血的病理损伤过程中起重要作用[4-5]，但对于脑缺血预处理后Calpain活性的变化国内外报道较少[6]。

本实验中钙蛋白酶活性检测试剂盒(biovision k240-100)，是基于钙蛋白酶底物Ac-LLY-AFC发出荧光，通过荧光的波长来预测钙蛋白酶的活性。Ac-LLY-AFC激发蓝光(波长400 nm)。钙蛋白酶切割后，自由的AFC可发出黄绿光(波长505 nm)，用荧光定量或荧光酶标仪可以读出荧光单位数值。通过比较处理组荧光与对照组样品的强度变化可以预测钙蛋白酶活性的变化。该试剂盒灵敏度高，特异性强，具有以下优点：仅检测活化的Calpain；试剂盒内的缓冲液和试剂均经优化；Extraction Buffer(抽提液)特异性抽提胞质溶胶(Cytosol)中的蛋白，而无细胞膜及溶酶体蛋白酶的干扰，且可防止抽提过程中Calpain的自发活化。

神经丝三联蛋白NF-L、NF-M、NF-H，是神经细胞的骨架蛋白，对于维持神经细胞的结构稳定、信号转导、轴浆运输等方面起重要作用。细胞骨架在颅脑损伤后15 min即可在损伤灶同侧及对侧被检测到有轻微的形态改变，并在24 h内降解逐渐加重[8-9]。研究证实脑损伤后NF-H的表达量会有明显的改变。由于早期即有明显的改变，因此有学者探讨其是否可作为颅脑损伤的早期损伤标志物[10]。颅脑损伤后，由于各种原因会导致Ca2+内流，从而引起钙蛋白Calpain酶的激活[11-12]。Calpain的持续激活将会导致一系列相关底物，如细胞骨架蛋白、受体和通道蛋白、信号酶、凋亡蛋白、转录和翻译蛋白等的水解[13]。研究颅脑损伤后脑组织中Calpain的活性变化及其对病情变化的影响是颅脑损伤研究的热门领域，探索Calpain的颅脑损伤机制甚至开发出Calpain特效抑制剂将有可能为外伤后护提供一条新的思路。神经丝蛋白被公认为Calpain 的底物。Calpain的激活将会导致NF的水解，因此不同时段的NF-H的量及形态变化将会可以间接反映出钙蛋白酶活性的变化。本实验结果表明，颅脑损伤后神经丝解聚增多，神经丝结构发生紊乱，24 h降解达到高峰，与研究[8-9]结果一致。Calipain活性则随时间变化不断升高，24 h时达到最高点，随后逐渐降低。

实验研究表明，颅脑损伤后，神经丝的解聚及神经丝蛋白的降解增加，其机制可能与颅脑损伤后Calpain活性升高有关，至于通过何种途径发挥这种作用则需要进一步讨论，临床上颅脑损伤早期可以采取各种措施降低Calpain活性，从而缓解神经丝的解聚，从而起治疗作用，因此抑制Calpain的活化成为寻找抗脑缺血药物的一个新的靶点。

综上所述，颅脑损伤后，神经丝的解聚及神经丝蛋白的降解逐渐增加，于伤后24 h时降解达到高峰，随后逐渐恢复；颅脑损伤后，Calpain活性逐渐增强，于伤后24 h时活性达到最高点，随后逐渐降低；颅脑损伤后24 h内，通过各种有效的措施降低Calpain活性可能抑制神经丝的解聚和神经丝蛋白降解，这可能是治疗颅脑损伤的新途径，值得进一步研究。

4参考文献

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(收稿 2015-06-15)

Study of the changes of neurofilaments and the activity of Calpain after brain injury in adult rats and their relationship

WangYuanchuan，ZhangTao，YinXiaohong，ZhaoLong，DuanJunwei，LiShun，YangBinbin，KuangRenzhao

DepartmentofNeurosurgery，theAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000，China

【Abstract】Objective To investigate the changes of the cortical neurofilaments and the activity of Calpain after brain injury in adult rats，and discuss the relations and the significance between them.Methods Twenty-five male Wistar rats were random1y divided into the control group(n=5)and TBI group(n=20).The TBI group was further sub-divided into 4 groups according to the time elapsed post injury(6h，12h，24h，72h after TBI).The TBI models were produced by a Myneurolab Stereotaxic Apparatus and a Benchmark Stereotaxic Impactor.Subsequently，the changes of the cortical neurofilaments was detected by immunohistochemical staining，and the changes of the activity of the calpain were detected.Results Expression of NF-H/L decreased at 6h after the TBI，continued to reduced at 6h and 12h，and reached the lowest point at 24h，then rised，the activity of the calpain increased over time，reached the highest point at 24h，then decreased. Conclusion The mechanism of the degradaion of neurofilaments after brain injury maybe has a relationship with the activity of the calpain.

【Key words】Brain injury；Neurofilaments；Calpain；Change of the activity

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)11-0012-03