热射病大鼠中eNOS和iNOS 基因的表达

叶建新　林　航　穆军山　崔晓萍

南京军区福州总医院神经内科　福建医科大学福总临床医学院　福州　350025

热射病大鼠中eNOS和iNOS 基因的表达

叶建新林航穆军山崔晓萍

南京军区福州总医院神经内科福建医科大学福总临床医学院福州350025

【摘要】目的研究热射病大鼠中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达。方法构建经典型和劳力型热射病大鼠模型，利用实时荧光定量PCR方法检测不同热射病大鼠模型的脑、肝、肾和心脏组织中eNOS和iNOS 基因的表达情况。结果2种热射病大鼠中，eNOS和iNOS mRNA在脑、肝、肾和心脏组织中的表达量均高于对照组；eNOS mRNA在劳力型热射病大鼠各器官中的表达量高于经典型热射病大鼠(P<0.05)；iNOS mRNA在经典型热射病大鼠的脑、肝和肾组织中的表达量低于劳力型热射病大鼠(P<0.05)，在心脏组织中，二者无显著性差异(P>0.05)。结论eNOS和iNOS mRNA的上调表达在热射病发病机制中发挥重要作用。

【关键词】内皮型一氧化氮合酶；诱导型一氧化氮合酶；热射病；大鼠

热射病(heat stroke，HS)是一种致死率较高的中暑类型，80岁以上患者病死率可达80%，具有发病快的特征，早期受影响的器官主要是脑、肝、肾和心脏[1]。NO是生物体内调节血管舒张、细胞免疫等的重要信号因子。在热射病发病机制中伴随NO含量的异常。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是调节机体NO含量的重要蛋白[2]，因此本文构建热射病大鼠，并研究在热射病大鼠的脑、肝、肾和心脏中eNOS和iNOS的表达情况。

1材料和方法

1.1材料人工实验环境模拟舱(本院实验研究中心)；分光光度计；RT-6000全自动酶标仪(美国Bio-rad公司)；Powlab/8sp生理记录仪(澳大利亚instruments公司)；大鼠直肠温度传感器(北京渠道科学器材有限公司)；ZH-PP型计算机控制动物实验跑台(美国通用限公司)。

1.2方法

1.2.1热射病大鼠模型制备：选择SPF级♂SD大鼠90只(本院动物研究中心提供)，体质量(190±11.4)g，适应性饲养7 d，温度为23 ℃，湿度(55±5)%，并进行15 min/d、30 m/min的跑台适应性训练。随机选择10只为正常对照组(NC组)，40只构建经典型热射病(classic heat stroke，CHS)大鼠模型，40只构建劳力型热射病(exertional heat stroke，EHS)大鼠模型。NC组维持原有饲养条件，CHS组和EHS组于40 ℃模拟舱中饲养，湿度(65±0.5)%，EHS组进行30 m/min的跑台训练，每运动30 min休息10 min。实验期间禁食禁水8 h。

1.2.2生理指标测量和标本采集：实验结束后分别测量3组大鼠的直肠体温(core temperature，Tr)、呼吸频率(respiratory rate，RR)、平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)和心率(heart rate，HR)。活杀大鼠，取出脑、肝、肾和心脏组织置于液氮中保存。

1.2.3mRNA提取与cDNA制备：分别从保存的脑、肝、肾和心脏组织中取100 mg组织置于液氮中研磨，利用mRNA提取试剂盒提取mRNA，利用一步法cDNA反转录试剂盒(美国天根公司)获得cDNA。

1.2.4实时荧光定量PCR检测各组织中eNOS和iNOS表达水平：利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行real-time PCR实验。引物分别为：eNOS-F：5’-ACGCCCGTCTTCCACCA-3’；eNOS-R：5’-ACGCCTTCACTCGCTTCG-3’；iNOS-F：5’-CCTCGGCTCCAGCATGTAC-3’；iNOS-R：5’-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3’；GAPDH-F：5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’；GAPDH-R：5’-CAGTTGGTGGTACAGGAGGC-3’。反应条件为90 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，重复45个循环。利用2-△△t进行计算。

2结果

2.1正常大鼠与热射病大鼠的生理指标CHS组和EHS组的直肠体温、呼吸频率、平均动脉压和心率均高于正常大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。与CHS组相比，EHS组直肠体温、呼吸频率、平均动脉压和心率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　正常大鼠与热射病大鼠的生理指标比较±s)

注：与NC组相比，①P<0.05；与CHS组相比，②P<0.05

2.2正常大鼠与热射病大鼠各器官eNOS mRNA表达水平CHS组和EHS组大鼠的脑组织中eNOS mRNA表达水平分别为对照组的1.34和1.69倍，在肝脏组织中分别为对照组的1.46和1.73倍，在肾组织中分别为对照组的1.68和1.88倍，在心脏组织中分别为对照组的1.68和1.75倍，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，CHS组大鼠脑、肝、肾和心脏组织中eNOS mRNA表达水平均低于EHS组(P<0.05)。见图1。

图1　eNOS mRNA相对表达量

2.3正常大鼠与热射病大鼠各器官iNOS mRNA表达水平CHS组和EHS组大鼠的脑组织中iNOS mRNA表达水平分别为对照组的1.14和1.33倍，在肝脏组织中分别为对照组的1.346和1.65倍，在肾组织中分别为对照组的1.52和1.87倍，在心脏组织中分别为对照组的1.44和1.76倍，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，CHS组大鼠的脑、肝和肾组织中eNOS mRNA表达水平均低于EHS组(P<0.05)，但在心脏组织中，CHS组与EHS组无明显差异(P>0.05)。见图2。

图2　iNOS mRNA相对表达量

3讨论

热射病发病迅速，前期具有头晕乏力、体温升高(≥40 ℃)、皮肤干热等病征，继而可引发永久性神经损伤和外周组织损伤，是致死率较高的中暑疾病。热射病分为经典型热射病和劳力型热射病。其中经典性热射病多见于老年人及免疫功能受损人群，多由长时间暴露于高温高湿度环境造成。劳力性热射病多见于运动员和士兵等年轻个体，由在高温高湿度环境中剧烈长时间运动造成[3-5]。

本实验通过构建经典型热射病和劳力型热射病大鼠模型，对热射病的发病机制进行研究。通过测定对照组、CHS组和EHS组大鼠的直肠体温、呼吸频率、平均动脉压和心率发现，CHS组和EHS组大鼠的直肠体温、呼吸频率、平均动脉压和心率均高于对照组，且EHS组也高于EHS组，这与不同类型热射病的临床病征相符，说明所构建的经典型热射病和劳力型热射病大鼠模型可以用于研究热射病的相关病理特征。

热射病早期出现功能异常的器官主要是脑、肝、肾和心脏，主要表现为脑部神经受损、肝功能衰竭、肾衰竭及心脏衰竭等现象。NO作为细胞信号因子参与调节机体内的多种生理活动，包括神经传递、血管舒张、细胞免疫和细胞微环境的构建等[6]。当机体内NO含量增加，可能神经细胞受损，脑组织损伤，过度炎症反应甚至器官功能衰竭。在热射病病人中，常伴NO含量异常增高的现象，因此，NO含量可能是导致热射病病人全身炎症反应综合征及其介导多器官功能障碍综合征的重要诱因之一。

机体调节NO含量主要依赖于内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。eNOS是一种钙调节蛋白，主要存在于动脉血管壁的内皮细胞，其合成的NO主要参与调节血管收缩，保持血压稳定和血流正常供应[7]。iNOS在正常情况下表达量较低，当有细胞因子、药物及胁迫条件处理时，表达量增加，主要参与单核巨噬细胞调节的炎症反应过程中血管生成，也参与平滑肌细胞和内皮细胞中的血管扩张及生成[8]。因此，本文重点研究了在不同热射病大鼠的脑、肝、肾和心脏中eNOS和iNOS的表达情况。

通过real-time PCR实验发现，与正常大鼠相比，热射病大鼠的脑、肝、肾和心脏中的eNOS mRNA表达水平明显增高，且在劳力型热射病大鼠的各器官中，eNOS mRNA表达水平高于经典型热射病大鼠。与肝、肾和心脏相比，热射病大鼠脑中eNOS mRNA的表达水平增加幅度较小，这可能是由于脑部主要的NO调节酶是以同为钙调性的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)为主造成的。与eNOS mRNA表达趋势类似，在正常组大鼠各器官中，iNOS mRNA表达水平低于热射病大鼠，且经典型热射病大鼠的脑、肝和肾组织中iNOS mRNA表达水平低于劳力型热射病。值得注意的是，在心脏组织中，劳力型热射病大鼠的iNOS mRNA表达水平与经典型热射病大鼠无显著性差别(P>0.05)，说明iNOS在不同热射病大鼠模型的心脏组织中的功能差异并不明显。本文结果显示，eNOS和iNOS在热射病大鼠中表达量均有所上调，在热射病大鼠的脑、肝、肾和心脏中均发挥重要作用。

4参考文献

[1]Casa DJ，Armstrong LE，Kenny GP，et al.Exertional heat stroke：new concepts regarding cause and care[J].Curr Sports Med Rep，2012，11(3)：115-123.

[2]Luo S，Lei H，Qin H，et al.Molecular mechanisms of endothelial NO synthase uncoupling[J].Curr Pharm Des，2014，20(22)：3 548-3 553.

[3]Epstein Y，Roberts WO.The pathopysiology of heat stroke：an integrative view of the final common pathway[J].Scand J Med Sci Sports，2011，21(6)：742-748.

[4]Yankelson L，Sadeh B，Gershovitz L，et al.Life-threatening events during endurance sports：is heat stroke more prevalent than arrhythmic death?[J].J Am Coll Cardiol，2014，64(5)：463-469.

[5]Kerr ZY，Marshall SW，Comstock RD，et al.Exertional heat stroke management strategies in United States high school football[J].Am J Sports Med，2014，42(1)：70-77.

[6]Förstermann U，Sessa WC.Nitric oxide synthases：regulation and function[J].Eur Heart J，2012，33(7)：829-837.

[7]Gong X，Ma Y，Ruan Y，et al.Long-term atorvastatin improves age-related endothelial dysfunction by ameliorating oxidative stress and normalizing eNOS/iNOS imbalance in rat aorta[J].Exp Gerontol，2014，52：9-17.

[8]Pakdeechote P，Bunbupha S，Kukongviriyapan U，et al.Asiatic acid alleviates hemodynamic and metabolic alterations via restoring eNOS/iNOS expression，oxidative stress，and inflammation in diet-induced metabolic syndrome rats[J].Nutrients，2014，6(1)：355-370.

(收稿 2015-06-02)

The expressions of eNOS and iNOS mRNA in heat stroke rats

YeJianxin，LinHang，MuJunshan，CuiXiaoping

DepartmentofNeurology，FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，PLAandClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity，Fuzhou350025，China

【Abstract】Objective To observe the expressions of eNOS and iNOS mRNA in heat stroke rats.Methods We constructed classic heat stroke rats model and exertional heat stroke rats model，then real-time PCR was used to value the expression of eNOS and iNOS mRNA in brain，liver，kidney and heart in heat stroke rats and normal rats.Results The expressions of eNOS and iNOS mRNA in brain，liver，kidney and heart in heat stroke rats were higher than those in normal rats，the expression of eNOS was lower in classic heat stroke rats than that in exertional heat stroke rats.iNOS mRNA expressed more in brain，liver and kidney in exertional heat stroke rats than classic heat stroke rats，but there was no significant difference in heart between the two models.Conclusion The elevate expressions of eNOS and iNOS mRNA influence the progress of heat stroke.

【Key words】eNOS；iNOS；Heat stroke；Rat

基金项目：南京军区医学科技创新课题(编号：MS130)

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)11-0007-02