人参亲环素蛋白原核表达及其抗真菌活性

李帅军，才可新，张楠楠，孙天霞，赵　雨，曲　毅,2*

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，长春 130117;2.吉林省食品药品安全监测中心，长春 130033)

人参亲环素蛋白原核表达及其抗真菌活性

李帅军1，才可新1，张楠楠1，孙天霞1，赵雨1，曲毅1,2*

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，长春 130117;2.吉林省食品药品安全监测中心，长春 130033)

摘要：目的研究人参亲环素蛋白(pgCyP)体外抗真菌活性。方法采用RT-PCR技术,扩增人参cyclophilin(pgCyP)基因片段，构建原核表达质粒并转入大肠杆菌中，利用IPTG诱导表达目的蛋白，通过亲和纯化获得pgCyP蛋白，纸片扩散法验证目的蛋白的抗菌活性。结果人参CyP基因全长为522个碱基,编码174个氨基酸；目的蛋白经纯化后,SDS-PAGE分析显示单一条带;抑菌试验表明该重组蛋白可明显抑制疫霉菌菌丝的生长。结论成功克隆并表达具有抗菌活性的pgCyP蛋白,为进一步研究pgCyP在人参抗真菌中的作用机制奠定了基础。

关键词：亲环素；人参；原核表达；纯化；抗真菌活性

目前，人们已经从植物中分离出了许多抗菌蛋白如几丁质、亲环素、防御素凝集素和脂质转移蛋白等[1-6]。亲环素(CyP)是一类免疫因子，可以和免疫抑制剂环孢素A特异性结合[7]，广泛存在于各种生物体，具有PPIase活性，能催化Xaa-Pro肽键异构化，在多种生理活动中发挥重要的作用[8]。目前已发现亲环素对多种真菌具有抑制能力，许多亲环素类抗真菌蛋白已经从黑脐豆、绿豆、白菜和鹰嘴豆等植物中鉴定获得[9-11]。本研究通过构建人参亲环素原核表达载体，并针对目的蛋白进行抗疫霉菌生物活性研究，为今后人参抗病害研究提供技术支撑。

1材料

1.1材料5年生人参(PanaxginsengC.A Meyer)样品采自吉林省抚松县人参种植产业基地；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)本实验室保存；人参疫病(Phytophthora cactorum)由吉林农业大学中药材学院韩梅教授提供并鉴定；载体pGEX-6p-1由吉林大学生命科学院提供；Ni-chelating sepharose FF购自美国GE公司。

1.2试剂T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH I、Not I、RT-PCR试剂盒购自TakaRa生物工程(大连)有限公司。

2方法

2.1人参CyP原核表达质粒构建根据人参CyP(pgCyP)基因的cDNA序列设计特异性引物上游5’- CGGATCCATGGCCAACCCAA-3 ’，下游引物5’- ATT

TGCGGCCGCGTGGTG，GTGGTGGTGGTGCTCGAG-3’，PCR扩增，将扩增片段连接到pMDTM18-T并进行测序，BamH I和Not I双酶切，将目的基因连接到表达载体pGEX-6p-1，获得重组质粒pGEX-6p-1-pgCyP，质粒鉴定后转化BL21(DE3)。

2.2诱导表达将阳性克隆菌株接种到20 mL LB(Ampicillin)培养基中，37 ℃，200 r/min振荡过夜，然后按1%(V/V)接种量转接至100 mL LB(Ampicillin)培养基中，振荡培养至OD600到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37 ℃，200 r/min振荡诱导5 h，离心取沉淀。分别对诱导前和诱导后菌沉淀进行SDS-PAGE分析。

2.3蛋白纯化诱导后菌离心，取沉淀重悬于Wash Buffer，4 ℃低温离心后，沉淀重悬于Lysis Buffer，加入适量的DNase I( 浓度为2 000 U/mL )冰浴超声30 min。将菌体裂解液以10 000×g，4 ℃离心20 min。弃上清收集包涵体并使用变性剂溶解；透析复性后，包涵体溶解液上清用0.2 μM滤膜过滤，Ni-chelating sepharose FF亲和层析柱纯化蛋白，用含100、500 mmol/L咪唑的Elution Buffer分别洗脱蛋白，收集洗脱流穿峰，最后用SephadexG-25 除盐柱脱盐处理，采用Bradford方法测定目的蛋白浓度。

2.4体外抗菌活性实验将疫霉菌接种在PDB培养液中，28 ℃培养3 d后，用121 ℃高温灭菌的8层纱布收集真菌孢子液，取经灭菌水稀释至一定浓度的孢子液80 μL转移至96孔板中，后在孔中加20 μL一定浓度的蛋白溶液，以加入GST载体蛋白和缓冲液为对照，28 ℃ 恒温培养24 h。根据菌液OD值绘制生长曲线，判断真菌对pgCyP蛋白的敏感程度。

3结果

3.1pgCyP原核表达载体构建及鉴定结果表明，基因全长522 bp，编码174个氨基酸。基因片段连入pGEX-6P-1载体并扩增，质粒经BamH I和Not I双酶切鉴定，获得约520 bp和4.9 kb两条带(见图1)，大小与目的片段和载体片段相符。

3.2诱导表达及纯化结果表明，在约46 kDa处有明显的条带(图2泳道3)，而且以包涵体形式高表达(图2泳道5)。结果符合预期。经Ni亲和层析纯化后，获得了纯度较高的重组蛋白(图2 泳道9)。

3.3蛋白对真菌的抑制试验结果显示，重组蛋白对疫霉菌具有明显的抑制作用，半抑制率的浓度为2.55 μmol/L。

1 DNA Maker　2 质粒pGEX-6p-1-pgCyP双酶切图1　质粒酶切鉴定

1 Pr Maker　2 pGEX-6P-1　3 诱导菌体　4 菌体裂解上清5 菌体裂解沉淀　6 包涵体溶解液　7 蛋白循环上样后8 蛋白纯化后流穿　9 纯化后洗脱收集液图2　蛋白表达纯化

4小结

本课题组在前期工作中已应用Illumina Hiseq-2000高通量测序技术建立了人参叶片转录组数据库，通过数据分析，发现了一条cDNA序列为亲环素基因，并且该基因的转录水平与人参易患病时期密切相关。推测人参亲环素在人参患病时期高表达，很可能是一种抗真菌蛋白。实验中得到了人参亲环素的全长基因，对于今后从基因表达水平方面研究亲环素基因在人参的生长发育及代谢过程中的作用具有重要意义。利用pGEX-6P-1作为表达载体，成功构建了人参亲环素原核表达体系，并在大肠杆菌中实现了融合蛋白表达。在插入片段C端插入6个组氨酸标签，为下游分离纯化亲环素蛋白提供了良好条件。纯化的重组蛋白也为未来制备人参亲环素抗体提供了实验材料。

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Prokaryotic expression of ginseng cyclophilin and the detected of antifungal activity

LI Shuaijun1,CAI Kexin1,ZHANG Nannan1,SUN Tianxia1,ZHAO Yu1,QU Yi1,2*

(1.Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Jilin Changchun 130117,China;2.Jilin Safety Monitoring Center for Food and Drug,Changchun 130033,China)

Abstract：ObjectiveWe investigated the antifungal activity of panax ginseng cyclophilin (pgCyP) in vitro.MethodsIn this study,we amplified pgCyP gene by RT-PCR,constructed prokaryotic expression plasmid and transformed into E.Coli.Target protein was induced by IPTG and affinity purified.Disc diffusion method was used to verify the antifungal activity of target protein.ResultsThe full length of pgCyP gene is 522 bp,which codes for a protein 174 amino acids in length.After purified,the target protein showed a single band in SDS-PAGE.Antifungal test showed that the recombinant protein can obviously inhibit the growth of the Phytophthora cactorum.ConclusionpgCyP was successfully cloned,expressed and antifungal activity characterization,which provides foundation for further research of pgCyP antifungal mechanism.

Keywords：Cyclophilin;Panax ginseng;prokaryotic expression;purification;antifungal activity

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.009

基金项目：吉林省经济结构战略调整引导资金专项项目(2014N155)。

作者简介：李帅军(1987-),男,硕士研究生,主要从事中药学研究。

*通信作者：曲毅,女，博士，助理研究员，电话-(0431)86172300，电子信箱-quyi1229@163.com

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2016)03-0464-03

收稿日期:(本栏责任编辑：张海洋2016-03-21)