牛膝不同提取部位抗炎镇痛及抗迟发型超敏反应的作用

汪　蓉，沈　晨，吴　虹，王　伟，孙亮亮，李淑萍

(安徽中医药大学药学院　安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥　230012)

牛膝不同提取部位抗炎镇痛及抗迟发型超敏反应的作用

汪蓉，沈晨，吴虹，王伟，孙亮亮，李淑萍

(安徽中医药大学药学院安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥230012)

[摘要]目的观察牛膝不同提取部位的抗炎镇痛及抗迟发型超敏反应的作用。方法采用二甲苯致小鼠耳肿胀实验、热板实验及醋酸诱导小鼠扭体实验，观察牛膝不同提取部位的抗炎镇痛作用；采用2，4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)诱导的小鼠迟发型超敏反应来观察牛膝不同提取部位的抗迟发型超敏反应作用。结果牛膝的正丁醇提取部位能显著减轻二甲苯所致小鼠耳肿胀(P<0.05)，显著延长小鼠在热板上的舔足时间以及减少醋酸诱导的小鼠扭体次数(P<0.05)，明显降低DNCB诱导的迟发型超敏反应小鼠的耳肿胀度、胸腺指数及脾指数(P<0.05)；石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位对二甲苯诱导的炎症、热板和醋酸诱导的疼痛及DNCB诱导的迟发型超敏反应之部分指标有明显抑制作用(P<0.05)。结论牛膝的正丁醇提取部位具有显著的抗炎镇痛以及抗迟发型超敏反应作用。

[关键词]牛膝；提取部位；抗炎；镇痛；迟发型超敏反应

牛膝(AchyranthisBidentataeRadix)为苋科多年生草本植物牛膝的干燥根[1]，主要产于河南，是常用的中药[2]。其味甘、酸、苦，性平，入肝和肾经。具有散瘀通经、引血下行、引诸药下行、补肝肾、强筋骨之功效，常用于月经不调、痛经、闭经、产后瘀阻腹痛、跌打损伤、腰膝酸痛、下肢无力、尿血、小便不利、尿道涩痛等病证[3-7]。牛膝含有糖类、皂苷类、植物甾酮类、黄酮类等多种化学成分[8-11]。现代药理研究[12-16]表明，牛膝还具有抗炎、镇痛、调节免疫、降血压、抗肿瘤、延缓衰老等药理作用。现代临床上常用来治疗膝关节炎、心血管疾病、哮喘等[17-18]。

本课题组前期通过水提醇沉方法对牛膝粉末进行提取，再分别利用正丁醇、乙酸乙酯和石油醚溶剂进行萃取，最终得到牛膝中不同极性部位(正丁醇提取部位含量为50.3%，乙酸乙酯提取部位含量为25.6%，石油醚提取部位含量为13.9%)。本研究在此基础上，探讨牛膝不同极性提取部位的抗炎、镇痛及抗迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity, DTH)的作用，找出其抗炎镇痛的有效部位，为牛膝“引诸药下行”的功效提供实验依据。

1材料

1.1实验动物健康昆明种小鼠，生产许可证号为SCXK(苏)2011-0003，雌雄各半，体质量(20±2)g，由安徽医科大学实验动物中心提供。在恒温(24±2)℃、在明暗各12 h的光照周期中饲养1周后用于实验。

1.2药物与试剂正清风痛宁片：每片含盐酸青藤碱20 mg，湖南正清制药集团股份有限公司生产，批号 1404105；牛膝粉末：购自安徽省中药材公司，经安徽中医药大学药学院中药教研室鉴定，符合《中华人民共和国药典》2010版的要求；二甲苯：江苏强盛功能化学股份有限公司，批号 20121220；冰乙酸：上海苏懿化学试剂有限公司，批号 20130720；2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)；丙酮：上海苏懿化学试剂有限公司，批号 20130220。牛膝不同部位的提取方法：称取牛膝药材粉末适量，加12倍量的水，提取3次，每次0.5 h，加入无水乙醇至指定浓度，滤过，滤液蒸至无醇味；依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，得到正丁醇层、乙酸乙酯层和石油醚层，再分别蒸干石油醚、乙酸乙酯和正丁醇，得到干膏，备用。

1.3仪器和设备微量移液器：德国Eppendorf；JY10001电子天平：上海良平仪器；XS105 DU电子天平：瑞士Mettler Toledo；8 mm直径打孔器；RB-200智能热板仪：四川省成都泰盟科技有限公司。

2方法

2.1二甲苯致小鼠耳肿胀实验[19-20]取健康昆明种雄性小鼠40只，随机分为5组，每组8只，分别为空白对照组(同容积生理盐水灌胃)、正丁醇提取组(120 mg/kg)、乙酸乙酯提取组(120 mg/kg)、石油醚提取组(120 mg/kg)、正清风痛宁阳性对照组(80 mg/kg)。连续灌胃给药5 d，每日1次，末次给药后1 h，在每只小鼠右耳正反两面均匀涂抹20 μL二甲苯致炎，左耳作为对照。致炎后50 min将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓剪下左右耳，用8 mm打孔器打下耳片，称质量，计算肿胀度及肿胀抑制率。肿胀抑制率=(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100%。

2.2小鼠热板实验[21]将健康昆明种雌性小鼠置于(55±0.5)℃热板仪上，记录小鼠舔足时间，凡舔足时间小于5 s或大于30 s以及喜跳跃的小鼠都舍弃，取两次测量的平均值作为基础痛阈值。分组同“2.1”项，每组8只，连续灌胃给药5 d，每日1次，末次给药后0.5、1、2、3、4 h分别测量小鼠痛阈值，凡舔足时间大于60 s，则按60 s 计算。

2.3醋酸诱导小鼠扭体实验[19,21]健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，分组同“2.1”项，每组8只，连续灌胃给药5 d，每日1次，末次给药后1 h，分别腹腔注射0.6%醋酸溶液(10 mL/kg)，记录15 min内小鼠扭体次数，与空白对照组比较，计算扭体抑制率。

2.4DNCB诱导小鼠迟发型超敏反应[22]取健康昆明种小鼠48只，雌雄各半，随机分为6组，每组8只，分别为空白对照组、DTH模型组、正丁醇提取组、乙酸乙酯提取组、石油醚提取组和正清风痛宁阳性对照组。第1天给药后每只小鼠腹部去毛，范围约3 cm×3 cm，并将50 μL 1.0% DNCB丙酮麻油溶液均匀涂抹于腹部，空白对照组涂抹等容积丙酮麻油溶液，次日强化1次作为致敏。致敏6 d后，将1.0% DNCB丙酮麻油溶液10 μL均匀涂于各小鼠右耳(正反两面)进行致敏，左耳作为对照。致敏24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器打下直径为8 mm的耳片，称质量，同时取小鼠脾和胸腺称质量。以左右耳片质量差作为肿胀度。称质量后将右耳片保存在4%中性甲醛溶液中固定，采用常规方法进行石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，显微镜下观察耳组织病理变化。

3结果

3.1牛膝不同提取部位对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响用二甲苯致炎后，各组小鼠右耳均出现明显红肿。各组小鼠耳肿胀度比较，差异具有统计学意义(F(4,35)=317.22，P=0.000)。由表1可知，与空白对照组比较，正清风痛宁组、正丁醇部位组和石油醚部位组小鼠耳肿胀度显著减轻(P<0.05)，乙酸乙酯部位组小鼠耳肿胀度无明显变化(P>0.05)。

表1　牛膝不同提取部位对二甲苯致

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与正丁醇部位组比较，#P<0.05。

3.2牛膝不同提取部位对小鼠热板疼痛反应的影响两因素混合设计的不等距重复测量数据的方差分析结果显示，被试内因素(时间)对痛阈的主效应具有统计学意义(F(2.89,101.12)=159.95，P=0.000)，被试间因素(组别)对痛阈的主效应具有统计学意义(F(4,35)=15.26，P=0.000)，时间和组别对痛阈的交互作用也具有统计学意义(F(11.56,101.12)=15.26，P=0.000)。由图1可知，各组基础痛阈(给药后0.0 h痛阈)比较，差异无统计学意义(P>0.05)；分别从给药后1.0、1.5 h开始，正清风痛宁组和正丁醇部位组痛阈显著高于空白对照组(P<0.05)；正清风痛宁组和正丁醇部位组痛阈在给药后3.0 h上升至最大值(P<0.05)，给药后4.0 h开始明显降低(P<0.05)。

注：与同时点空白对照组比较，*P<0.05；与同组给药后1.0 h比较，aP<0.05；与同组给药后2.0 h比较，bP<0.05；与同组给药后3.0 h比较，cP<0.05。

图1牛膝不同提取部位对小鼠热板疼痛反应的影响

3.3牛膝不同提取部位对醋酸诱导的小鼠扭体反应的影响各组小鼠扭体反应次数比较，差异具有统计学意义(F(4,35)=67.59，P=0.000)。由表2可知，与空白对照组比较，正清风痛宁组和正丁醇部位组小鼠扭体次数显著降低(P<0.05)，乙酸乙酯部位组和石油醚部位组小鼠扭体次数无明显变化(P>0.05)。

表2　牛膝不同提取部位对醋酸诱导的

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与正丁醇部位组比较，#P<0.05。

3.4牛膝不同提取部位对DNCB诱导的DTH的影响以空白对照组和DTH模型组为实验组合进行两个独立样本t检验，结果显示，与空白对照组比较，DTH组小鼠耳肿胀度、胸腺指数和脾指数显著升高(P<0.05)。以空白对照组以外的另5组为实验组合进行单因素方差分析，结果显示，5组小组耳肿胀度、胸腺指数和脾指数比较，差异均具有统计学意义(耳肿胀度：F(4,35)=40.76，P=0.000；胸腺指数：F(4,35)=55.31，P=0.000；脾指数：F(4,35)=100.01，P=0.000)；与DTH模型组相比较，正清风痛宁组和正丁醇部位组小鼠耳肿胀度、胸腺指数和脾指数均显著降低(P<0.05)，乙酸乙酯部位组耳肿胀度和胸腺指数显著降低(P<0.05)，石油醚部位组小鼠耳肿胀度、胸腺指数和脾指数均无明显变化(P>0.05)。见表3。光镜下观察各组小鼠耳片组织的病理学变化，结果显示：空白对照组小鼠耳组织表皮角质化不明显，炎性细胞浸润较少；DTH模型组耳组织表皮角质化明显加厚，炎性细胞浸润增多；正丁醇部位组和正清风痛宁组小鼠耳组织病理变化明显改善；乙酸乙酯部位组和石油醚部位组小鼠耳组织病理变化无明显改善。见图2。

表3　牛膝不同提取部位对DNCB

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与DTH模型组比较，#P<0.05。

注:A.空白对照组;B.DTH模型组;C.正丁醇部位组;D.乙酸乙酯部位组;E.石油醚部位组;F.正清风痛宁组。

图2牛膝不同提取部位对DTH小鼠耳片组织病理变化的影响(HE染色，10×20倍)

4讨论

炎症是机体活组织在各种损伤刺激下所表现的以防御为主的反应[21]。二甲苯诱导的耳肿胀模型是最常见的急性炎症模型，二甲苯能增加毛细血管壁的通透性，导致红肿。本实验结果表明，正丁醇和石油醚提取部位能明显抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀，说明正丁醇和石油醚提取部位能降低血管壁的通透性，减轻肿胀度；乙酸乙酯部位基本无作用。研究表明在伤害性刺激作用下，组织释放各种致痛因子，如H+、K+、组织胺、前列腺素，刺激痛受体，使游离神经末梢产生痛觉传入冲动，冲动传至高级中枢引起痛觉。理论上，阻断该过程的任一环节，均可产生镇痛效应[21]。实验结果表明，正丁醇部位明显延长小鼠在热板上舔足时间，明显减少醋酸诱导小鼠扭体反应次数，提示其具有一定的镇痛作用；乙酸乙酯和石油醚提取部位基本无作用。

DTH是依赖T淋巴细胞的反应，其主要特征是致敏机体在抗原攻击部位，出现迟发型炎性反应。胸腺与脾脏是机体主要的免疫器官，其中脾脏是免疫细胞定居的场所，也是免疫应答的场所；胸腺是T细胞发育的主要场所。机体发生超敏反应的同时，脾脏和胸腺肿大，其质量增加，脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱[23-25]。DNCB是一种半抗原，将其稀释液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白形成完全抗原，刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞[22]。4～7 d后再将其涂抹于耳部，使局部产生DTH，一般在抗原攻击后24～48 h达高峰，此时测其肿胀度。实验结果表明，正丁醇部位能显著减轻小鼠耳肿胀度，降低胸腺指数及脾指数，提示其能抑制体内的免疫反应；乙酸乙酯部位能有效降低小鼠耳肿胀度及胸腺指数但对脾指数无明显作用，提示其有一定的抑制体内免疫反应的作用，石油醚提取部位不能抑制DNCB诱导的DTH。

本研究显示，牛膝的正丁醇部位的抗炎镇痛及抑制DTH作用均明显不及正清风痛宁，说明中药复方的作用有一定的优势。今后应优化提取工艺，以挖掘牛膝抗炎镇痛有效部位中活性更强的单体或组合物，深入探究其抗炎镇痛的作用机制，进一步尝试与现有治疗类风湿关节炎的药物联用，充分发挥其“引诸药下行”的作用，提高抗炎药物在类风湿关节炎病变组织中的药物浓度。

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Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Different Extracts ofAchyranthisBidentataeRadix and Their Effects against Delayed-type Hypersensitivity

WANGRong,SHENChen,WUHong,WANGWei,SUNLiang-liang,LIShu-ping

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory and analgesic effects of different extracts of Achyranthis Bidentatae Radix and their effects against delayed-type hypersensitivity (DTH). MethodsThe dimethylbenzene-induced mouse ear-swelling test, hot plate test, and acetic acid-induced mouse writhing test were performed to observe the anti-inflammatory and analgesic effects of different extracts of Achyranthis Bidentatae Radix. The 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) was used to induce DTH in mice, and the effects of different extracts of Achyranthis Bidentatae Radix against DTH were examined.ResultsThe n-butyl alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix significantly reduced the ear swelling induced by dimethylbenzene (P<0.05), significantly prolonged the licking time on hot plate and reduced the times of writhing induced by acetic acid (P<0.05), and significantly reduced ear swelling, thymus index, and spleen index in mice with DNCB-induced DTH (P<0.05). The petroleum ether and ethyl acetate extracts of Achyranthis Bidentatae Radix significantly inhibited some indices of the inflammation induced by dimethylbenzene, the pain induced by hot plate and acetic acid, and DNCB-induced DTH (P<0.05). ConclusionThe n-butyl alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix has significant anti-inflammatory, analgesic, and anti-DTH effects.

[Key words]Achyranthis Bidentatae Radix; Extract; Anti-inflammatory; Analgesic; Delayed-type hypersensitivity

基金项目：国家自然科学基金项目(81473400，81073122)；安徽中医药大学青年研究基金项目(2015qn014)

作者简介：汪蓉(1991-)，女，硕士研究生

通信作者：吴虹，hongw@aliyun.com

[中图分类号]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.023

(收稿日期：2015-09-16；编辑：姚实林)