MicroRNA-196b基因在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

王 薇，于宝丹，李玉莲，曹冉华，闫海成(1.内蒙古医科大学附属医院 a.肿瘤内科，b.病理科，c.神经外科，内蒙古 呼和浩特 10010；.广州医科大学附属第一医院肿瘤血液科，广东 广州 510000)

MicroRNA-196b基因在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

王 薇1a，于宝丹2，李玉莲1b，曹冉华1a，闫海成1c
(1.内蒙古医科大学附属医院 a.肿瘤内科，b.病理科，c.神经外科，内蒙古 呼和浩特 100102；2.广州医科大学附属第一医院肿瘤血液科，广东 广州 510000)

目的 探讨非小细胞肺癌组织中MicroRNA-196b的表达及其临床意义。方法 收集2013年5月至2015年5月在我院接受治疗的65例非小细胞肺癌患者肺癌组织及其对应的癌旁组织，采用实时荧光定量PCR技术对组织样本中MicroRNA-196b的表达情况进行检测，分析其与患者临床病理因素的关系；评价MicroRNA-196b在非小细胞肺癌诊断中的效能。结果 非小细胞肺癌患者癌组织中MicroRNA-196b的表达量明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P< 0.05)。癌组织中MicroRNA-196b的表达水平与淋巴结转移、TNM分期、病理分型密切相关(P< 0.05)，而与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小以及分化程度无关联性(P> 0.05)。癌组织中MicroRNA-196b最佳检测临界值为0.879，检测灵敏度和特异度分别为78.5%、90.8%。结论 MicroRNA-196b在非小细胞肺癌患者肺癌组织中呈高表达，其表达水平与淋巴结转移、TNM分期、病理分型有关；癌组织MicroRNA-196b可作为临床非小细胞肺癌诊断的辅助检测指标。

MicroRNA-196b；非小细胞肺癌；PCR

肺癌是目前发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌(non-small cell lung cance，NSCLC)作为肺癌中最常见的病理类型，占肺癌总发生率的80%～85%，其五年生存率低于15%[1～3]。NSCLC的早期症状缺乏典型特征，导致70%～80%患者确诊时已发生转移，失去了最佳手术时机。因此，寻找一种能够有效诊断NSCLC的分子标志物是目前医学界亟待解决的问题[4]。微小RNA(microRNA)的出现为癌症的诊断和治疗提供了新思路，microRNA是一种小分子单链RNA，长度为19～30个核苷酸，在肿瘤的发生和发展中起重要作用[5]。近年研究发现，MicroRNA-196b在乳腺癌、口腔癌、结直肠癌、淋巴瘤、白血病以及肝癌等肿瘤组织中过表达，其表达量与肿瘤的分期和患者的预后密切相关[6，7]，但对于非小细胞肺癌组织中MicroRNA-196b的表达水平的研究甚少。本研究探讨MicroRNA-196b在NSCLC患者癌及癌旁正常组织中的表达，分析其与临床病理参数的相关性，并探讨MicroRNA-196b在NSCLC早期诊断中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年5月至2015年5月在本院收治的65例病理学确诊的非小细胞肺癌患者，所有患者均未采取任何放化疗以及生物治疗等抗癌治疗。其中男41例，女24例，年龄34～81岁[(62.75±8.96)岁]；淋巴结转移36例，无淋巴结转移29例；鳞癌23例，腺癌42例；低分化11例，中分化45例，高分化9例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期14例。手术获取肿瘤组织及癌旁正常组织标本，经生理盐水清洗后液氮速冻，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 RNA提取试剂盒：miRNeasy Mini Kit (Qiagen公司)；逆转录试剂盒：miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen公司)；荧光定量PCT试剂盒：miScript SYBR Green PCR Kit (Takara公司)；微量移液器(Eppendorf公司)，DU-600型紫外分光光度计(Beckman公司)，ABI-7500 fast RT-PCR仪(美国Ambion 公司)，高速冷冻离心机(Eppendorf 公司)。

1.2.2 引物与内参 根据GenBank中已知的人类MicroRNA-196b基因的cDNA序列，利用Primer premier 6.0 进行特异性引物设计，由上海生物工程有限公司合成，miR-196b上游引物采用PCR试剂盒中的 miScript Universal Primer，下游引物序列为：5′-TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-3′。内参U6引物序列如下：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 标本总RNA提取 根据miRNeasy Mini Kit的操作说明书进行总RNA提取，分别在260和280 nm测定RNA溶液吸光值(A)，计算RNA纯度和浓度，选择A260/A280在1.8～2.1者进行后续试验。

1.2.4 MicroRNA-196b逆转录反应 逆转录反应体系为5×miRNA反应缓冲液4 μl，miRNA Prime Script 逆转录酶混合液 1.0 μl，RNA模板(600 ng)1 μl，RNase-free 水补至20 μl。反应条件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；合成后的cDNA置于-20 ℃备用。

1.2.5 q-PCR反应 采用miScript SYBR Green PCR Kit三步法对miR-196b进行PCR扩增，以U6为内参照，做3个复孔重复；反应体系为：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 2 μl，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 2 μl，cDNA模板1 μl，加水补至20.0 μl。反应条件：预变性97 ℃ 10 min，95 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，70 ℃延伸34 s，做40个循环，计算Ct平均值。采用2-△△Ct法计算MicroRNA-196b基因在癌组织及其癌旁组织中的表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计量资料采用均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析；采用Spearman检验进行相关性分析，采用受试者工作特征曲线(ROC)评价MicroRNA-196b在肺癌早期诊断中的价值。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MicroRNA-196b在癌及癌旁组织中的表达 肺癌组织中MicroRNA-196b的表达量为(1.751±1.29)，而癌旁组织中MicroRNA-196b的表达量为(0.484±0.372)，两者比较，差异有统计学意义(t=10.953，P= 0.000)。

2.2 MicroRNA-196b基因与临床病理因素的关系

肺癌组织中MicroRNA-196b的表达水平与性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小以及分化程度比较，差异无统计学意义(P> 0.05)；而MicroRNA-196b的表达与淋巴结转移、TNM分期、病理分型比较，差异有统计学意义(P< 0.05)。见表1。

表1 MicroRNA-196b基因与临床病理因素的关系

2.3 MicroRNA-196b基因对NSCLC的诊断价值

组织MicroRNA-196b对NSCLC诊断的ROC曲线下面积为0.908(95%CI：0.859～0.958)，最佳检测临界值为表达水平>0.879，检测灵敏度为78.5%，特异度为90.8%，见图1。

图1 MicroRNA-196b表达诊断NSCLC的ROC曲线

3 讨论

肺癌是全球发病率最高的肿瘤之一，随着各种肿瘤标志物的深入研究，MicroRNA也得到了医学界的关注[8]。MicroRNA是广泛存在于真核生物中的单链小分子RNA，由于其不编码蛋白质，曾被认为是转录本的“噪音”。然而近年来研究发现，MicroRNA能够抑制靶mRNAs的转录和翻译以及促进mRNAs降解，参与机体细胞的增殖、分化、代谢和凋亡等生理调控过程，尤其在肿瘤的发生、发展中具有至关重要的作用[9，10]。

目前报道的肺癌相关MicroRNA约有40余种，包括miRNA-21、miRNA-141、miRNA-210等[11]。MicroRNA-196b是位于人类7号染色体(7p15.2)的高度保守区域，能够结合不同靶基因，从而发挥抑癌或者致癌作用。国内外研究发现[12，13]，MicroRNA-196b在多种肿瘤组织中均呈高表达，其表达量与癌症的进展以及患者预后和生存期显著相关。Liao等[14]对63例胃癌组织及正常组织检测发现，MicroRNA-196b在胃癌组织中高表达，当敲除MicroRNA-196b基因后，转移性胃癌HR细胞的迁移和侵袭得到抑制；进一步研究其作用机理发现，MicroRNA-196b是通过与具有抑制肿瘤作用的转录因子ETS2相结合，而促进癌细胞的转移。田庆刚等[15]采用实时荧光定量PCR技术对47例结直肠癌患者癌组织中miR-196b进行检测，结果发现miR-196b在直肠癌组织中表达显著增高，其水平与结肠癌的恶化程度密切相关，且miR-196b对机体序列特异性转录因子HoxB8具有抑制作用。徐丽华等[16]研究了miR-196b在急性髓细胞白血病(AML)儿童骨髓中的表达发现，骨髓miR-196b水平与儿童AML的发生相关，经过治疗预后良好患儿miR-196b水平明显降低。MicroRNA-196b在NSCLC中的研究相对较少，Saito等[17]应用ROC曲线研究了miR135、miR196b、miR31等12种miRNA对肺腺癌的诊断价值，结果发现包括miR196b在内的三种miRNA对肺腺癌的诊断效能较高，三种miRNA联合检测可大大提高肺腺癌的诊断准确度。然而miRNA对NSCLC诊断效能的研究尚不多见。

本研究对NSCLC患者癌组织及正常组织中MicroRNA-196b表达水平进行检测，结果显示MicroRNA -196b在癌组织中的表达明显高于癌旁组织，提示MicroRNA-196b的高表达与NSCLC的发生相关；进一步采用ROC曲线分析MicroRNA-196b对NSCLC的诊断效能，结果显示MicroRNA-196b对于NSCLC诊断的最佳检测临界值为>0.879，诊断灵敏度和特异度分别为78.5%，90.8%；提示MicroRNA-196b对NSCLC诊断的效能较高，有助于临床上NSCLC的快速诊断，减少误诊。另外，本研究还分析了各病理因素患者癌组织中MicroRNA-196b的表达水平，研究发现存在淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期以及腺癌患者的癌组织中的表达均明显高于无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期以及鳞癌患者，说明MicroRNA-196b的表达水平与淋巴结转移、肿瘤的分期以及病理分型均密切相关；分析MicroRNA-196b参与NSCLC的发展，且对肺腺癌的发生可能具有一定的特异性；因此，对癌组织MicroRNA-196b进行检测，有助于判断NSCLC的进展和组织学分型，对NSCLC治疗过程采取最佳治疗方案提供依据。

综上所述，MicroRNA-196b在NSCLC组织中呈高表达，其表达水平与NSCLC的病理类型以及恶化程度等相关，MicroRNA-196b可作为临床NSCLC诊断的辅助检测指标。

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Expression and clinical significance of MicroRNA-196b in non-small cell lung cancer

WANGWei1a，YUBao-dan2，LIYu-lian1b，CAORan-hua1a，YANHai-cheng1c
(1.AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity，a.DepartmentofInternalMedicine-Oncology，b.DepartmentofPathology，c.DepartmentofNeurosurgery，Hohhot010050，China； 2.DepartmentofHematology&Oncology，TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510000，China)

YANHai-cheng

Objective To explore the expression and clinical significance of MicroRNA-196b in non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Samples of cancer tissues and corresponding para-carcinoma tissues were collected from 65 patients with NSCLC from May 2013 to May 2015 in our hospital.Real-time fluorescence quantitative PCR technique was used to detect the level of MicroRNA-196b in these tissue samples.The correlation between the expression of MicroRNA-196b and clinicopathologic characteristics was analyzed and the diagnostic efficiency of MicroRNA-196b in NSCLC was evaluated.Results The expression of MicroRNA-196b in cancer tissues was significantly higher than that in corresponding para-carcinoma tissues (P< 0.05).The expression of MicroRNA-196b in cancer tissues was closely correlated with lymph node metastasis，TNM stage and pathological type (P< 0.05) but not correlated with gender，age，smoking history，tumor size and differentiation (P> 0.05).The best detection threshold of MicroRNA-196b for early diagnosis of NSCLC was 0.879 with 78.5% sensitivity and 90.8% specificity，respectively.Conclusion The expression level of MicroRNA-196b is significantly increased in cancer tissues of NSCLC.The MicroRNA-196b level is related to lymph node metastasis，TNM stage and pathological type.It has a good clinical value for early diagnosis of NSCLC.

MicroRNA-196b； Non-small cell lung cancer； PCR

内蒙古自然科学基金资助项目(编号：2015MS0831)；内蒙古医科大学青年创新基金资助项目(编号：YKD2014QN CX009)

闫海成

R734.2

A

1672-6170(2016)05-0061-04

2016-03-16；

2016-06-01)