MiR-125a诱导表达与顺铂抵抗的鼻咽癌细胞株凋亡相关性的研究

胡琼英，艾承锦，张 爽，熊大千，江泽友，赵梓亦，张朝明(1.成都中医药大学附属医院.检验科；.科研部中心实验室，四川 成都 610071)

MiR-125a诱导表达与顺铂抵抗的鼻咽癌细胞株凋亡相关性的研究

胡琼英a，艾承锦a，张 爽a，熊大千a，江泽友a，赵梓亦b，张朝明a
(1.成都中医药大学附属医院a.检验科；b.科研部中心实验室，四川 成都 610071)

目的 探讨顺铂抵抗的鼻咽癌细胞株TW03微小RNA-miR-125a表达情况，为顺铂治疗鼻咽癌的耐药性寻找新的分子靶点和标志物。方法 建立顺铂抵抗的鼻咽癌细胞株TW03 细胞模型(TW03/DDP)，提取细胞中的总RNA，实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)分析该细胞株中miR-125a表达情况，过表达miR-125a和anti-miR-125a后，检测TW03细胞的凋亡和增殖情况。结果 顺铂抵抗的鼻咽癌细胞株中miR-125a的表达增高，后者可抑制顺铂抵抗的鼻咽癌细胞株凋亡。结论 顺铂抵抗的鼻咽癌细胞株诱导表达miR-125a可抑制鼻咽癌细胞株凋亡。

鼻咽癌；顺铂抵抗； miR-125a；凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是东南亚及我国东南地区好发的恶性肿瘤之一，在我国发病呈南高北低趋势，发病率为20/10万～30/10万，而在欧美的发病率<1/10万，发病有明显的种族、地区和家族聚集现象，以青壮年男性为主[1]。鼻咽癌的治疗以放疗为主，但约有30%的放疗患者预后较差，临床上常常使用顺铂进行化疗，促进鼻咽癌细胞的凋亡[2]。然而，顺铂化疗的突出问题是产生药物耐性，即顺铂抵抗，制约了鼻咽癌化疗的疗效[3]。探讨顺铂抵抗的下游机制，是研究顺铂耐药机制的关键。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的小非编码RNA分子，可以调控真核细胞的基因表达、增殖、分化、凋亡等一系列生物学行为[4，5]。据报道，miR-125a与肿瘤细胞的分化、迁移和侵袭等生物学行为密切相关，其功能的实现主要通过翻译后调控靶基因如ERBB2/3、BAK1和p53来实现，而后者是调控鼻咽癌细胞凋亡的靶基因。本研究进一步研究顺铂耐药诱导的miR-125a表达情况及其调控鼻咽癌细胞凋亡和增殖的影响，探索顺铂抵抗的下游分子机制，以期为鼻咽癌的化疗应用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和处理 鼻咽癌细胞株TW03由美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)提供，顺铂耐药的TW03耐药株(TW03/DDP)的获取是将TW03细胞与含顺铂(300 nM)DMEM培养基(Gibco Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)共孵育3周筛选而来，最终TW03耐药株的顺铂筛选浓度稳定为10 μM。

1.2 转染 将TW03细胞接种于12孔板，每孔密度为5×105个，转染采用脂质体2000 (Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)，与miRNA共孵育48小时，转染后的TW03细胞用冰磷酸盐缓冲液冲洗，收集细胞，待分析。miR-125a的mirVana miRNA mimic批号为MC12378，miR-125a的mirVana®miRNA inhibitor批号为12378，均购自Life Technologies (Carlsbad，CA，USA)公司，使用浓度为5 nM。

1.3 提取RNA和RT-qPCR分析miRNAs 使用Trizol (Life Technologies)试剂盒提取培养细胞的总RNA，提取RNA的浓度通过测量在260 nm处的吸光度值分析待用。实时RT-PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)试剂盒miScript SYBR-Green PCR Kit(Qiagen，Mississauga，ON，Canada)分析提取的RNA。miR-125a的引物和内部质控U6 snRNA购自Qiagen。

1.4 CCK8试剂盒分析TW03细胞凋亡情况 转染后的TW03细胞接种于96孔板，每孔密度为2.5×104个，加入混有DDP (1～15 μM)的培养基，共孵育24、48 和 72小时，然后加入CCK8试剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，每孔10 μl，37 ℃孵育4小时，在450 nm和590 nm波长检测吸光度。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株(TW03/DDP)对顺铂治疗的反应性及has-miR-125a表达 顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株相对于正常TW03细胞株而言，随着顺铂用药浓度的增加，对癌细胞的活性抑制作用无明显变化(图1a)。进一步检测miR-125a在顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株和正常TW03细胞株两组中的表达水平，发现其在顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株中高表达(图1b)。

2.2 顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株转染miR-125a拮抗基因(miR-125a-ASOs)后对顺铂的反应性 为了进一步确定miR-125a对顺铂抵抗的诱导作用，拮抗顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株中miR-125a(has-miR-125a-ASOs)，发现转染miR-125a-ASOs后TW03细胞株对顺铂用药浓度的反应更为敏感，随着顺铂浓度的增加，TW03癌细胞的活性抑制作用增强(图2)。

图1 顺铂抵抗的确定及miR-125a的表达情况 a:顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株(TW03/DDDP)和普通鼻咽癌TW03细胞株对顺铂浓度变化的反应情况；b:RT-PCR检测顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株(TW03/DDDP)和普通鼻咽癌TW03细胞株中miR-125a的表达情况。

图2 过表达miR-125a-ASOs后顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株对顺铂的反应情况

2.3 过表达miR-125a可诱导鼻咽癌TW03细胞株的顺铂抵抗作用 为了阐明miR-125a与顺铂抵抗的关系，过表达miR-125a(miR-125a mimic)，发现与未治疗组比较，30 μM顺铂作用下，转染miR-125a mimic组TW03细胞凋亡比例最小,与未转染和过表达miR-125a-ASOs组比较，转染miR-125a mimic组在顺铂的作用下抑制癌细胞生长比例最高(图3a，图3b)；顺铂作用后，随着时间的推移，过表达miR-125a后普通的鼻咽癌细胞株TW03组与顺铂抵抗的鼻咽癌细胞株TW03组比较，细胞增殖能力增强(图4)。

图3 过表达miR-125a抑制鼻咽癌细胞株TW03凋亡情况

图4 过表达miR-125a对鼻咽癌细胞株TW03增殖的抑制情况 *与TW03/DDP比较，P < 0.05

3 讨论

已有文献证实，microRNAs广泛参与了鼻咽癌的发生、发展及预后。Wang等[6]研究了miR-429负性调控鼻咽癌的机制，认为其可以成为鼻咽癌治疗和预后的监测指标；Xu等[7]报道，miR-124-3p可通过下调STAT3的转录，从而促进鼻咽癌细胞凋亡和抑制其增殖；Ou等[8]报道miR-21可被STAT3激活，从而通过PTEN-AKT信号通路诱导鼻咽癌细胞增殖，抑制其凋亡；Deng等[9]发现miR-214通过AKT信号通路负性调控乳运铁蛋白的表达，从而负性调控鼻咽癌细胞的生长；Liu等[10]证实细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 4(CDK4)和miR-15a是鼻咽癌发病机制的反馈刺激因子，并可诱导化疗药物耐受。有关microRNAs与顺铂化疗抵抗的关系，已有部分文献报道:Shen等[11]研究MicroRNA-137可降低顺铂药物在肺癌化疗的敏感性；Zhou等[12]报道下调microRNA-375可以通过调节ERBB2增加顺铂对胃癌细胞的化疗敏感性。有关miR-125a在癌症中的研究，已有文献报道:Dai等[13]显示miR-125a可通过血管内皮生长因子A调节胃癌血管形成。Lehmann等[14]认为miR-125a等可以作为乳腺癌分级、受体状态和分子类型的潜在分子标志物。尽管文献基础有关顺铂耐药的microRNAs和miR-125a在其他癌症中的应用已有报道，但目前有关miR-125a在顺铂对鼻咽癌耐药中的研究还未见报道，探索miR-125a在顺铂抵抗的鼻咽癌治疗过程中的作用，对鼻咽癌的化疗非常重要。

本研究证实顺铂抵抗的鼻咽癌TW03细胞株对顺铂治疗反应性降低并高表达has-miR-125a，miR-125a是顺铂耐药诱导的关键基因，顺铂抵抗时，其表达显著增高，可抑制癌细胞的凋亡，对癌细胞的增殖抑制作用也显著降低。为了进一步阐述miR-125a在顺铂抵抗中的作用，本实验过表达了miR-125a(miR-125a mimic)和anti-miR-125a (miR-125a-ASOs)，研究干预miR-125a基因对顺铂耐药的影响，结果发现:去除miR-125a基因的影响，顺铂耐药情况得到有效改善，鼻咽癌细胞的凋亡率增加，增殖率降低；反之，加强miR-125a基因的影响，可促使顺铂耐药的发生，鼻咽癌细胞的凋亡率降低，增殖率增加。所以本研究证实miR-125a是顺铂耐药的关键靶位点，这一发现可能为顺铂化疗耐药的解决找到新的分子靶点，也为下一步研究miR-125a调控顺铂抵抗的分子机制打下了坚实的基础。

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The relationship between MiR-125a induction expression and apoptosis of cisplatin resistant nasopharyngeal carcinoma cell line

HUQiong-ying1，AICheng-jin1，ZHANGShuang1，XIONGDa-qian1，JIANGZe-you1，ZHAOZi-yi2，ZHANGChao-ming1
(a.DepartmentofLaboratoryMedicine，b.CentralLaboratory，TeachingHospitalofChengduUniversityofTCM，Chengdu610072，China)

ZHANGChao-ming

Objective To search the novel molecule targets or biomarkers for cisplatin resistant patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC)，we detected the expression levels of miR125a in cisplatin resistant TW03 cells (TW03/DDP).Methods After construction of a cisplatin resistant TW03 cell model (TW03/DDP)，the expression levels of miR125a were examined by RT-qPCR.After over expression of miR-125a and application of anti-miR-125a，the apoptosis and proliferation of TW03 cells were examined.Results In the TW03/DDP cells，the expression levels of miR125a were up-regulated.The cisplatininduced expression of miR125a inhibited apoptosis of the TW03 cells.Conclusion The present study revealed that induction of the expression of miR125a by treatment with cisplatin results in resistance to the cisplatin drug in the NPC cells.

Nasopharyngeal carcinoma； Cisplatin resistance； miR-125a； Apoptosis

成都中医药大学科技发展基金资助项目(编号:030029045)

张朝明

R739.62

A

1672-6170(2016)05-0043-04

2016-05-10；

2016-06-24)