大麻二酚对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用和机制

2016-06-23 02:34孙姣卓
中西医结合心脑血管病杂志 2016年2期
关键词:细胞凋亡

孙姣卓,王 雄,张 萍

大麻二酚对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用和机制

孙姣卓1,王雄2,张萍2

1.山西医科大学(太原 030001);2.山西医科大学第一医院

摘要:目的探讨大麻二酚(CBD)对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。方法将健康雄性的SD大鼠32只,随机数字法分为假手术组、缺血再灌注组(I/R组)、大麻二酚组和大麻二酚腺苷A1阻断剂(DPCPX)处理组,每组8只,结扎左冠状动脉前降支(LAD)30 min,再灌注120 min,建立大鼠心肌缺血/再灌注模型。苏木素伊红染色法在光镜下观察大鼠心肌组织形态学改变,免疫组织化学法测定心肌组织中Bcl-2、Bax表达,黄嘌呤氧化酶法测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)浓度。结果与I/R组相比,大麻二酚组苏木素伊红染色心肌组织损伤小,差异有统计学意义(P<0.05);心肌组织Bcl-2蛋白表达增多,Bax表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);血清SOD活性较高,MDA浓度较低,差异有统计学意义(P<0.05)。当加腺苷A1阻断剂(DPCPX)后大麻二酚保护心肌I/R损伤作用减弱。结论大麻二酚保护大鼠心肌I/R损伤,其可能作用机制是通过腺苷A1途径抗凋亡、抗氧自由基等方面发挥作用。

关键词:心肌缺血再灌注损伤;大麻二酚;细胞凋亡;氧自由基

多发性硬化、舞蹈病、阿尔茨海默病、癫痫等仍是神经内科棘手的疾病。大麻二酚(CBD)目前在临床已用于治疗痉挛、多发性硬化、舞蹈病、疼痛、炎症[1-4],具有多种药理活性,包括抗氧化、抗炎、抗凋亡作用[5]。不少研究认为大麻二酚具有保护神经细胞作用,对癫痫、阿尔茨海默病有一定治疗前景[6-8]。所有这些药理活性证明它具有保护组织潜在作用。又有研究认为大麻二酚在治疗神经系统疾病同时可以保护心肌缺血再灌注损伤。对于患有多发性硬化、舞蹈病同时存在心肌缺血再灌注损伤的病人,大麻二酚具有双重优势。Walsh等[9]发现大麻二酚(50 μg/kg 静脉注射)可减少大鼠缺血再灌注心肌梗死面积,减少损伤炎性介质的释放;Durst等[10]也证明长时间应用大麻二酚可以减少缺血再灌注损伤。并有研究者发现大麻二酚可减少兔子缺血再灌注的心肌,左心室结构大小,改善收缩壁的厚度,促进心功能恢复等[11]。本实验拟通过观察大麻二酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)的表达及氧自由基释放[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)]作用,探讨大麻二酚对心肌保护的作用机制。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器大麻二酚(北京新奥源发有限公司,1 mg/mL,纯度≥98.5%),腺苷A1阻断剂(DPCPX,Sigma公司 规格C101-25MG),SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所);Bcl-2 Bax 免疫组化抗体(武汉博士德);HX-200动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司);rm6240B型生理实验系统(成都仪器厂);Scanscope数字病理扫描系统(美国Aperio公司)。

1.2动物分组和模型建立将32只雄性SD大鼠(230 g±30 g,北京提供)随机分为4组,每组8只。假手术组:开胸只穿线不结扎血管,麻醉维持150 min;缺血再灌注(I/R)组:缺血30 min,再灌注120 min;大麻二酚组(CBD组):缺血30 min,再灌注前10 min,股静脉快速推注大麻二酚50 μg/kg[9],之后再灌注120 min;大麻二酚+腺苷A1阻断剂组(CBD+DPCPX):缺血30 min,冠状动脉再通前15 min,股静脉快速静脉推注腺苷A1阻断剂100 μg/kg[12],前10 min股静脉快速推注大麻二酚50 μg/kg,而后再灌注120 min。大鼠以20%乌拉坦(4 mL/kg)腹腔麻醉,仰位固定,针形电极插四肢皮下连续监测Ⅱ导联心电图。设置微型动物呼吸机参数:呼吸频率为60次/min,潮气量8 mL~10 mL,吸呼比为1∶2。术区备皮消毒,沿大鼠颈部正中切开皮肤,钝性分离皮下组织及肌肉,暴露气管,做倒“T”型切口,气管插管,接微型动物呼吸机,观察大鼠呼吸情况。于大鼠胸骨左缘第3~4肋间开胸,暴露心脏,剪开心包膜,大致定位冠脉左前降支走行(有时肉眼可见与其伴行的静脉),一般距左心耳下缘约2 mm处进针穿线(6/0丝线),肺动脉圆锥旁出针,进针深度1 mm~1.5 mm,进针宽度1.5 mm~2 mm,再让线两头共同穿过一直径约4 mm的自制乳胶套管,轻提丝线,并沿丝线轻轻下推套管,止血钳夹闭套管造成心肌缺血,再灌注时松开止血钳。以心电图ST段明显抬高或QRS波显著增高、增宽,几乎与T波融合,结扎线以下心肌颜色变暗、出现发绀为心肌缺血成功标志。再灌注时ST段逐渐回落,心肌缺血区颜色逐渐转为红色、发绀消失。造模完成。将大鼠处死,取出心脏,用0.9%氯化钠注射液冲洗后放置于10%的甲醛溶液中固定,以备心肌组织形态学观察、免疫组化时用。血清与心肌组织标本置于-20 ℃冰箱中保存,统一送检。

1.3观测指标

1.3.1心肌HE病理组织学染色取缺血再灌注心肌组织常规脱水固定,石蜡包埋,切片,二甲苯脱蜡,苏木素-伊红染色,梯度乙醇脱水,封片,光学显微镜下观察。

1.3.2Bcl-2、Bax免疫组化再灌注120 min后,快速摘取心脏,取缺血再灌注心肌组织,10%中性甲醛溶液固定24 h,常规石蜡包埋,切片,脱蜡至水,按试剂盒说明进行Bcl-2、Bax,免疫组化染色,DAB显色,苏木精复染,脱水干燥,透明,中性树胶封片,显微镜下观察。在每张切片中随机选取3个视野拍照。Scanscope数字病理扫描系统测平均灰度值(与蛋白表达成反比)。

1.3.3血清SOD、MDA再灌注120 min后,腹主动脉采血,静置15 min~20 min后离心(3 000 r/min)取上清液存于Peppercorn管至-20 ℃冰箱保存,按试剂盒测检测MDA、SOD,721分光光度值测OD值。

2结果

2.1HE染色假手术组:心肌纤维排列整齐,无变性坏死与肿胀断裂。I/R组:心肌纤维肿胀,排列紊乱,部分心肌纤维断裂。与I/R组比较,大麻二酚组:心肌损伤有所减轻,心肌纤维轻度肿胀。与大麻二酚组比较,大麻二酚+腺苷A1阻断剂组:心肌损伤加重、心肌纤维肿胀。详见图1。

注:A1为假手术组;A2为I/R组;A3为大麻二酚组;A4为大麻二酚+腺苷A1阻断剂组。

图1各组心肌组织HE染色(×400)

2.2Bcl-2、Bax免疫组化灰度值Bcl-2、Bax蛋白阳性反应积聚于胞浆中,呈棕黄色(见图2、图3)。与假手术组比较,I/R组Bcl-2、Bax表达阳性细胞明显升高(P<0.05)。与I/R组比较,大麻二酚组Bcl-2表达阳性细胞继续升高,Bax表达阳性细胞减低(P<0.05)。与大麻二酚组比较,大麻二酚+腺苷A1阻断剂组Bcl-2表达阳性降低,Bax表达阳性细胞升高(P<0.05)。详见表1。

表1 各组Bcl-2、Bax免疫组化灰度值比较(±s)

注:B1为假手术组;B2为I/R组;B3为大麻二酚组;B4为大麻二酚+腺苷A1阻断剂组

图2各组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白免疫组织化学检测结果(×400)

注:C1为假手术组;C2为I/R组;C3为大麻二酚组;C4大麻二酚+腺苷A1阻断剂组。

图3各组大鼠心肌细胞Bax蛋白免疫组织化学检测结果(×400)

2.3血清SOD MDA吸光光度值与假手术比较,I/R组SOD水平降低,MDA水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与I/R组比较,大麻二酚组SOD水平升高,MDA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与大麻二酚组比较,大麻二酚+腺苷A1阻断剂组SOD水平较低,MDA水平较高,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组血清SOD、MDA吸光光度值结果(±s)

3讨论

缺血再灌注损伤过程中伴随有心肌细胞凋亡、炎症介质渗出、氧自由基的大量释放等[13]。细胞凋亡是一种有多种基因调控的细胞主动的死亡过程,其中Bcl-2基因家族是目前公认的与细胞凋亡密切相关的基因,有研究表明当细胞凋亡减弱时,Bcl-2表达增强;相反细胞凋亡增强时,Bcl-2表达减弱。Bax是Bcl-2家庭成员之一,其作用与Bcl-2相反,有对抗Bcl-2蛋白抗细胞凋亡,诱导细胞凋亡的作用[14-15]。本实验研究发现大麻二酚组心肌细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达较缺血再灌注组高,凋亡蛋白Bax表达较缺血再灌注组低,考虑大麻二酚通过升高抗凋亡蛋白Bcl-2表达,以及降低凋亡蛋白Bax表达来保护缺血再灌注损伤心肌,Stanley等[5]也有研究认为大麻二酚具有抗凋亡、抗炎、抗氧化作用。

SOD是体内重要的抗氧化酶,当机体内氧自由基生成增加时,可导致体内SOD消耗增加。MDA是氧自由基作用于不饱和脂肪酸所产生的脂质过氧化产物[16]。因而,SOD活性的降低和MDA的增加,表明氧自由基的大量生长,亦间接反映细胞损伤程度。在心肌缺血再灌注损伤中有大量氧自由基产生。本实验发现,大麻二酚组SOD活性较缺血再灌注组高,同时MDA浓度大麻二酚组较缺血再灌注组低,结果说明大麻二酚有清除氧自由基作用,可以通过升高体内SOD活性,减低MDA活性来发挥抗缺血再灌注损伤的作用。国外报道大麻二酚有抗氧化作用,但大麻二酚对SOD和MDA的作用报道甚少。

依据以上结果提示CBD可以抗缺血再灌注损伤,并且可能从抗凋亡、抗氧化发挥作用。CBD是竞争性平衡型核苷转运体抑制剂,可以抑制细胞内腺苷摄取,增加细胞外腺苷聚集,从而增加了内生腺苷受体活性及腺苷信号途径。大麻二酚通过增强腺苷信号传导途径激活腺苷A2受体具有抗炎作用[16-17],并且Durst等[8]研究认为大麻二酚可以通过增强腺苷途径保护缺血再灌注损伤。

CBD可以增强腺苷信号,从而激活腺苷A1受体,我们假设CBD可以通过激活腺苷A1受体保护缺血再灌注损伤进行试验,加用腺苷A1阻断剂,研究其抗凋亡、抗氧化机制。实验结果提示加用DPCPX组较大麻二酚组Bcl-2表达减低,Bax表达升高,提示CBD+DPCPX组心肌细胞凋亡增多,推测DPCPX阻断了腺苷A1的PKC途径,使CBD对心肌保护作用减弱[18];SOD活性较大麻二酚组低,MDA较高,可能DPCPX阻断了腺苷A1清除氧自由基的能力[19]。推测大麻二酚可以保护缺血再灌注心肌的损伤,其机制可能分别是通过腺苷A1途径中PKC途径抗凋亡,清除氧自由基发挥抗氧化作用。此实验结果与既往研究的大麻二酚通过激活腺苷途径保护心肌缺血再灌注损伤一致。

综上所述,认为大麻二酚可以保护大鼠缺血再灌注损伤的心肌,机制可能为通过腺苷A1途径,发挥抗凋亡、抗氧化的作用。对于受体后机制有待进一步研究。

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(本文编辑郭怀印)

通讯作者:王雄,E-mail:sxwangxiong@163.com

中图分类号:R542.2R256.2

文献标识码:A

doi:10.3969/j.issn.1672-1349.2016.02.008

文章编号:1672-1349(2016)02-0133-05

(收稿日期:2015-10-14)

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