人IgE-Fc结构域的基因克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

崔璐璐，毕嘉成，李俊鑫，刘绿艳，叶秀峰，郑明星，万晓春，于广



人IgE-Fc结构域的基因克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

崔璐璐，毕嘉成，李俊鑫，刘绿艳，叶秀峰，郑明星，万晓春，于广

【摘要】

目的通过制备小鼠抗人 IgE 单克隆抗体，为过敏性疾病的研究及诊断打下基础。

方法以 CRL8033 细胞的 cDNA 为模板扩增人 IgE Fcε3-4 段基因序列并将其连接到 pET-32a（+） 载体中，转化BL21（DE3）大肠杆菌并进行表达。然后将表达所得包涵体进行变复性，把复性所得蛋白进行亲和纯化，通过 SDS-PAGE验证纯化效果。最后将纯化的蛋白作为抗原免疫 BALB/c小鼠，经三次免疫后取小鼠脾脏细胞与 SP2/0 细胞融合。用 ELISA 法筛选出能结合人 IgE 蛋白的阳性克隆，并应用 ELISA、Western blot 等手段对杂交瘤所分泌单克隆抗体的特异性进行鉴定。

结果成功构建 pET-32a（+）-IgE Fcε3-4 载体并纯化 IgE Fcε3-4 蛋白。用该蛋白作为免疫原免疫小鼠，成功制备了杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体能够特异性结合人 IgE蛋白，可用于 ELISA、Western blot 等手段对人 IgE 的检测。

结论成功获得了可用于特异性检测人 IgE 蛋白的单克隆抗体，为人 IgE 的检测及哮喘等过敏性疾病的研究、诊断及治疗奠定了基础。

【关键词】免疫球蛋白 E；抗体，单克隆；过敏性疾病

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术, 2016, 11(3):242-246

作者单位：121001 辽宁，锦州医科大学基础医学院（崔璐璐、于广）；518055 深圳，中国科学院深圳先进技术研究院（毕嘉成、李俊鑫、刘绿艳、万晓春）；518035 深圳，广东省深圳市第二人民医院呼吸科（叶秀峰、郑明星）

IgE 在哮喘等过敏性疾病中发挥重要作用［1］，它由 B 细胞分泌［2］，通过与嗜酸性粒细胞［3］和肥大细胞［4］表面的 Fc 受体结合，导致其脱颗粒释放炎性介质，从而引起过敏症状。IgE 在健康人的血清中是含量最少的一种免疫球蛋白［5］，但它在过敏患者血清中的含量与患病程度及预后密切相关［6］，因而 IgE 含量的检测对哮喘等过敏性疾病的诊断、治疗及发病机制研究具有重要意义［7-8］。本研究旨在制备能特异性识别人 IgE 的单克隆抗体，为人 IgE的检测及哮喘等过敏性疾病的研究、诊断及治疗奠定基础。

1　材料与方法

1.1主要材料

扩增 IgE Fcε3-4 所用的 CRL8033 细胞由上海张江生物技术公司馈赠。DNA 及蛋白分子量标准、质粒小提及胶回收试剂盒购于北京康润诚业生物科技有限公司；pET32a（+）、BL21（DE3） 及 SP2/0细胞由本实验室保存；载体构建过程中使用的限制性内切酶、聚合酶均购自日本 Takara 公司；T4 连接酶购自美国 Thermo 公司。弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、PEG4000、HAT 及亚型鉴定试剂盒为美国 Sigma 公司产品；小鼠抗人 CTLA4 单克隆抗体由本实验室制备；细胞培养使用的 DMEM、FBS、青霉素-链霉素等试剂均为美国 Hyclone 公司产品；人全长 IgE 蛋白及商品化小鼠抗人 IgE单克隆抗体（B3102E8）购自美国 Abcam 公司；人 IgG 蛋白购自美国 Proteintech 公司。

1.2方法

1.2.1pET-32a（+）-IgE Fcε3-4 载体构建以 CRL8033 细胞 cDNA 为模板，扩增目的序列 IgE Fcε3-4。上游引物为：CCGGAATTCTCTGGGTACA CCCCAGGGACT（标记处为 EcoR I），下游引物为：CCGCTCGAGATGGACTGCACGGCAGATGAACT（标记处为 XhO I）。扩增条件：变性 94 ℃ 30 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1 min，共 35 个循环，最后再次延伸 2 min。将扩出片段胶回收后插入pET32a（+） 载体中，转化 DH5α 感受态细胞。阳性克隆经 Invitrogen 公司测序、比对 Genbank 数据验证为正确序列。

1.2.2IgE Fcε3-4 蛋白的原核表达将测序正确的菌液进行质粒提取并转化 BL21（DE3） 感受态细胞，通过菌液 PCR 鉴定阳性克隆。扩大培养正确菌液于 900 ml LB 培养基中（含有终浓度为50 μg/ml 的氨苄青霉素），于 37 ℃、220 r/min 振荡培养至 A600= 0.6 ～ 0.8，加入 IPTG 使其终浓度为 0.2 mmol/L，继续诱导培养 3 h 后收菌。

超声破碎菌体后 4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，向离心所得沉淀中加入 20 ml 包涵体裂解液并将其置入 4 ℃ 冰箱中旋转过夜裂解。次日取出后，4 ℃、12 000 r/min 离心 30 min。将离心所得上清液转移到透析袋内，分别经 8、4、2、1、0 mol/L尿素透析，除 2 mol/L 过夜透析外，其余梯度均每4 小时更换一次。每次更换梯度均向透析液内加入0.1 mmol/L 的 PMSF 5 ml 和 1 mol/L 的 DTT 1 ml。

透析结束后将透析袋中的蛋白转移至离心管，4 ℃、12 000 r/min 离心 30 min。所得上清液即为IgE Fcε3-4 融合蛋白，再用镍柱亲和层析的方法对所得蛋白进一步纯化。最后经 Bradford 蛋白定量、SDS-PAGE 蛋白电泳及 Western blot 验证纯化效果。

1.2.3小鼠免疫及血清抗体滴度测定用纯化的IgE Fcε3-4 融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠，共 6 只。第一次免疫用弗氏完全佐剂和蛋白 1∶1 等体积乳化，每只 100 μg 皮下多点注射。每间隔 2 周分别进行第 2 次和第 3 次免疫，后两次免疫用弗氏不完全佐剂与抗原蛋白乳化，其余方法同第一次免疫。第 3 次免疫后采血，用间接 ELISA 方法测定血清抗体滴度，具体步骤如下：用纯化的 IgE Fcε3-4融合蛋白包被 ELISA 板，12.5 ng/孔，4 ℃ 包被过夜；PBST 洗板 3 遍后加脱脂奶粉 180 μl/孔，37 ℃ 封闭 3 h；PBST 洗板 3 遍，加梯度稀释的血清，37 ℃ 孵育 1 h；洗板后加 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体，100 μl/孔，37 ℃ 孵育 30 min；最后一次洗板后加 TMB 避光显色 10 min，用2 mol/L 的浓硫酸终止反应，在酶标仪上检测OD450值。

1.2.4单克隆抗体制备第 3 次免疫后选取滴度高的小鼠进行加强免疫，3 d 后将小鼠脾脏细胞与 SP2/0 细胞采用 PEG 法进行细胞融合。通过HAT 加压筛选、ELISA 及 Western blot 筛选得到阳性克隆并对其进行亚克隆。将获得的杂交瘤细胞接种到 BALB/c 小鼠腹腔，再经腹水纯化即可得到抗人 IgE 抗体。

1.2.5抗体亚型鉴定用人全长 IgE 包被ELISA 板，37 ℃ 孵育 3 h。PBST 洗板 3 遍后加5% 的脱脂奶粉，37 ℃ 封闭 1 h。PBST 洗板后加入杂交瘤上清液，室温孵育 3 h。再次洗板后加入山羊抗小鼠 IgG1、山羊抗小鼠 IgG2a、山羊抗小鼠 IgG2b、山羊抗小鼠 IgM、山羊抗小鼠 IgA 抗体并在室温孵育 30 min。同样洗板后加 HRP 标记的驴抗山羊 IgG 抗体，室温孵育 15 min。洗板后加 TMB 避光显色 10 min，用 2 mol/L 的浓硫酸终止反应，在酶标仪上检测 OD450值。

1.2.6抗体特异性检测用 Western blot 来验证自制抗人 IgE 抗体与 IgG 是否有交叉反应，用商品化的人 IgE 和 IgG 加蛋白 Loading Buffer 煮沸变性后进行蛋白电泳，转膜后用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h。一抗用杂交瘤上清，4 ℃ 孵育过夜，PBST 洗 3 遍。二抗是 HRP 标记的山羊抗小鼠抗体，室温孵育 30 min，PBST 洗 3 遍，加 ECL 发光液曝光。

1.2.7ELISA 检测不同抗体对人 IgE 识别的浓度依赖性分别用纯化的抗人IgE单克隆抗体6A10和商品化的小鼠抗人IgE单克隆抗体（B3102E8）100 ng/孔包被 ELISA 板。常规封闭后，一抗用人全长 IgE 从 100 ng/孔作 4 倍梯度稀释。其余步骤同前。

2　结果

2.1人 IgE 的 Fc 结构域的克隆表达策略

为了制备出特异性识别人 IgE 而不识别其他免疫球蛋白的单克隆抗体，免疫原使用人 IgE 所特有的结构域（图1A）。以 CRL8033 细胞［9］的cDNA 为模板，PCR 克隆出对应序列的阅读框DNA 片段，连接到 pET-32a（+） 原核表达载体并转化 BL21（DE3） 表达菌。经 PCR（图1B）及测序鉴定，获得了带有正确抗原序列阅读框的表达菌株。

2.2人IgE的Fc结构域的蛋白表达、纯化与鉴定

经 IPTG 诱导菌株表达抗原蛋白后，采用蛋白电泳鉴定其表达产物，结果显示抗原蛋白主要以包涵体的形式存在（图2A）。包涵体经过变复性后通过镍柱亲和层析纯化。蛋白电泳（图2B）及 Western blot（图2C）结果表明抗原蛋白被成功纯化。

B：M：D2000 plus 分子量标准；1 ～ 6：IgE Fcε3-4 转化子B： M： D2000 plus molecular weight standard； 1 - 6： IgE Fcε3-4 transformants图1　人 IgE 的 Fc 结构域的克隆表达策略（A）和克隆转化子的菌液 PCR 鉴定（B）Figure 1　Cloning and expression strategy of human IgE-Fc domain （A） and transformants was characterized by PCR （B）

A：IPTG 诱导人 IgE-Fc 表达电泳（M：蛋白分子量标准；1：重组载体沉淀；2：空载体沉淀；3：重组载体上清；4：空载体上清）；B：SDS-PAGE （M：蛋白分子量标准；1：抗原蛋白）；C：Western blot（M：蛋白分子量标准；1：Trx 融合蛋白；2：抗原蛋白）A： Protein electrophoresis of induced expression of human IgE-Fc domain by IPTG （M： Protein molecular weight standard； 1： Precipitants of transformants；2： Precipitants of control bacteria； 3： Supernatants of transformants； 4： Supernatants of control bacteria）； B： SDS-PAGE （M： Protein molecular weight standard；1： Antigen protein）； C： Western blot （M： Protein molecular weight standard； 1： Trx fusion protein； 2： Antigen protein）图2　人 IgE 的 Fc 结构域的蛋白表达、纯化与鉴定Figure 2　Protein expression， purification and characterization of the Fc domain of human IgE

图3　抗人 IgE 的 Fc 结构域的单克隆抗体的制备［A：三次免疫后小鼠血清中抗人 IgE 抗体的滴度测定；1 ～ 6：免疫小鼠血清；7：对照小鼠血清（未免疫小鼠血清）；B：单克隆抗体 6A10 的抗体亚型测定］Figure 3　Preparation of monoclonal antibodies against human IgE-Fc domain （A： The titering of anti-human IgE antibody in the serum of mice after the third immunization； 1 - 6： Post-immunization serum； 7： Serum from control mouse； B： Determination of the subtype of monoclonal antibody 6A10）

图4　抗体识别人 IgE 的特异性检测结果［A：Western blot 检测不同抗体识别人 IgE 或人 IgG 的信号强弱（一抗使用以下抗体，1：B3102E8；2：小鼠抗人 CTLA4 单克隆抗体；3：6A10）；B：抗体识别人 IgE 的信噪比（1：B3102E8；2：小鼠抗人 CTLA4 单克隆抗体；3：6A10）；C：ELISA 检测不同抗体对人 IgE 识别的浓度依赖性］Figure 4　The specificity of mouse anti-human IgE monoclonal antibody ［A： Western blot detection of human IgE or human IgG antibodies （Primary antibodies used are as follows， 1： B3102E8； 2： Mouse anti-human CTLA4 monoclonal antibody； 3： 6A10）；B： Analysis of signal （bands of IgE） versus noise （bands of IgG） from the results of Western blot detection of human IgE in A （1：B3102E8； 2： Mouse anti-human CTLA4 monoclonal antibody； 3： 6A10）； C： 6A10 monoclonal antibody recognized human IgE by ELISA in a dose-dependent manner］

2.3抗人 IgE 的 Fc 结构域的单克隆抗体 6A10的制备

抗原对小鼠进行三次免疫后，小鼠体内产生了高滴度的抗体，同时对照小鼠的血清中没有检测到能识别抗原的抗体存在（图3A），这表明使用大肠杆菌表达的抗原蛋白能够在小鼠体内成功诱导出特异性识别人 IgE 的 B 细胞克隆。然后通过杂交瘤技术获得了一系列杂交瘤细胞株，并通过 ELISA筛选得到了一株高抗体滴度的杂交瘤细胞株6A10。经鉴定 6A10 所产生的单克隆抗体亚型为IgG2a（图3B）。

2.4单克隆抗体 6A10 能特异性识别人 IgE 蛋白

为了鉴定 6A10 单克隆抗体识别人 IgE 的特异性，将 6A10 纯化抗体与商品化的小鼠抗人 IgE抗体（B3102E8）及对照抗体作比较，观察它们通过 Western blot 检测人 IgE 及人 IgG 的信号强弱。结果显示，6A10 单抗能以强烈的信号检测到人 IgE 的存在，同时几乎无法检测出人 IgG（图4A）。若以检出人 IgE 的信号与检出人 IgG 的信号作比值，可以发现 6A10 检测人 IgE 的信噪比远远高于所测试的商品化小鼠抗人 IgE抗体（B3102E8）（图4B）。表明 6A10 能高度识别人IgE 蛋白。此外，ELISA 结果显示6A10 对人 IgE的识别还具有剂量依赖性（图4C）。

3　讨论

IgE 是过敏性疾病的重要效应分子，也是过敏性疾病的重要指标与治疗靶点，因而开发出高度特异性的抗人 IgE 单克隆抗体，对于过敏性疾病的研究、诊断与治疗均有重要意义。本研究通过将人IgE 蛋白的 Fc 结构域作为免疫原来免疫小鼠，借助杂交瘤技术最终获得能够分泌抗人 IgE 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定该杂交瘤分泌的单克隆抗体能高度特异地识别人 IgE。这种识别不仅具有剂量依赖性，而且对人 IgG 蛋白亦无交叉反应。因而可用 ELISA 及 Western blot 等方法在基础研究和临床诊断中对人 IgE 蛋白进行检测。该单克隆抗体的开发，为过敏性疾病的研究、诊断与治疗奠定了良好基础。

参考文献

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［2］ Gauchat JF， Henchoz S， Mazzei G， et al. Induction of human IgE synthesis in B cells by mast cells and basophils. Nature， 1993，365（6444）：340-343.

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Author Affiliations: Jinzhou Medical University， Liaoning 121001， China （CUI Lu-lu， YU Guang）； Shenzhen Institutes of Advanced Technology， Chinses Academy of Sciences， Shenzhen 518055， China （BI Jia-cheng， LI Jun-xin， LIU Lü-yan， WAN Xiao-chun）；Shenzhen Second People's Hospital， Shenzhen 518035， China （YE Xiu-feng， ZHENG Ming-xing）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):242-246

Cloning， expression of human IgE-Fc and generation of mouse anti-human IgE monoclonal antibody

CUI Lu-lu， BI Jia-cheng， LI Jun-xin， LIU Lü-yan， YE Xiu-feng， ZHENG Ming-xing， WAN Xiao-chun， YU Guang

【Abstract】

ObjectiveThis work aims at preparation of mouse anti human IgE monoclonal antibody， for research and diagnosis of allergic diseases.

MethodsIn this study， we first amplified the gene of IgE Fcε3-4 from the cDNA of CRL8033 cell line and cloned into pET-32a（+）expression vector. This recombinant vector was transformed into BL21（DE3） E.coli and the recombinant protein expression was induced by IPTG. The antigen obtained from the inclusion body was renatured and was purified by Ni2+affinity chromatography. The purity of the protein was assessed by SDS-PAGE. Finally we used the purified protein as an antigen to immunize BABL/c mice and the spleen cells were fused with SP2/0 after the third immunization. The hybridomas secreting monoclonal antibodies that could recognize human IgE was identified by ELISA and Western blot.

ResultsWe successfully constructed the pET-32a（+）-IgE Fcε3-4 expression vector， purified the antigen from inclusion body， and used the purified protein as an antigen to immunize mice. Successfully prepared hybridoma cell lines secretes monoclonal antibodies capable of specifically recognize human IgE， which can be used for ELISA and Western blot to detect human IgE.

ConclusionWe successfully obtain a monoclonal antibody which can be used to specifically detect human IgE protein， laying the foundation for diagnosis and treatment of asthma and other allergic diseases.

【Key words】Immunoglobulin E；Antibodies， monoclonal；Allergy disease

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.008

基金项目：深圳市科创委基础研究项目（JCYJ20130401113257009）；深圳市孔雀计划团队引进资助项目（1110140040347265）

通信作者：于广，Email：ly65401@sina.cn；万晓春，Email：xc.wan@ siat.ac.cn

收稿日期：2016-02-14

Corresponding Authors: YU Guang， Email： ly65401@sina.cn； WAN Xiao-chun， Email： xc.wan@siat.ac.cn