FSP1在小鼠巨噬细胞中的表达特征及其生物学意义

李必一，杨帆，李洋，王若雨，赵勇



FSP1在小鼠巨噬细胞中的表达特征及其生物学意义

李必一，杨帆，李洋，王若雨，赵勇

【摘要】

目的探讨 FSP1 在小鼠巨噬细胞中的表达特征及其在巨噬细胞功能的意义。

方法以 FSP1-GFP 小鼠作为研究对象，采用流式细胞染色检测 FSP1 在小鼠巨噬细胞中的表达情况；应用多种细胞因子对 FSP1-巨噬细胞进行刺激，观察 FSP1 的表达情况；应用过氧化氢（H2O2）对巨噬细胞进行氧化应激诱导，并观察其 FSP1 的表达情况及上清中 FSP1 的浓度；流式检测 FSP1-和 FSP1+的巨噬细胞细胞因子分泌情况及吞噬功能。

结果腹腔巨噬细胞和骨髓诱导来源的巨噬细胞均可被分为 FSP1+和 FSP1-两群。随着 H2O2刺激腹腔巨噬细胞时间延长，FSP1+巨噬细胞的比例下降，ELISA 检测上清中的 FSP1 浓度增加；刺激 FSP1+和 FSP1-两群巨噬细胞对 LPS 诱导的 IL-6、IL-12、TNF-α 等促炎性细胞因子无明显差异；FSP1-的腹腔巨噬细胞对鸡红细胞及乳胶微球的吞噬能力高于 FSP1+巨噬细胞。

结论依据巨噬细胞对 FSP1 的表达可将巨噬细胞分为FSP1+和 FSP1-两群。FSP1+巨噬细胞经 H2O2刺激分泌大量 FSP1 蛋白。这两群巨噬细胞对促炎性细胞因子的分泌无明显差异，但 FSP1-巨噬细胞的吞噬能力高于 FSP1+巨噬细胞。

【关键词】钙结合蛋白质类；巨噬细胞；吞噬能力

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术, 2016, 11(3):236-241

作者单位：116001 大连大学附属中山医院肿瘤科（李必一、王若雨）；100101 北京，中国科学院动物研究所膜生物学国家重点实验室（杨帆、李洋、赵勇）

成纤维细胞特异性蛋白（fibroblast-specific protein 1，FSP1）是属于 S100 蛋白家族的一种与肿瘤转移相关的钙结合蛋白，多项临床试验证实FSP1 钙结合蛋白在多种恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等转移中发挥重要作用，并与预后不良具有高度相关性［1-6］。近年来，FSP1 在免疫细胞中的表达及其生物学作用越发受到人们的关注，并且多项研究表明 FSP1 与多种自身免疫性疾病，如银屑病、关节炎等密切相关［7-8］。最近研究结果表明，FSP1+成纤维细胞促进胸腺上皮细胞的增殖以及细胞成熟［9］。然而尽管有报道显示 FSP1 蛋白在小鼠的发育期间对巨噬细胞的分化和功能有着重要的作用［10］，但是 FSP1 在巨噬细胞中的表达情况以及其影响机制尚不清楚。本文主要研究 FSP1 在巨噬细胞的表达情况以及对巨噬细胞功能的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物6 ～ 8 周龄 FSP1-GFP 小鼠，由中国科学院生物物理研究所秦志海研究组提供，所有 SPF 级小鼠均按照中国科学院动物研究所实验动物管理委员会规定饲养于本所 SPF 级 IVC 动物房，所有实验均严格遵照国际实验动物应用和管理条例进行。

1.1.2试剂及抗体牛血清白蛋白（BSA）、PBS（粉末）和 anti-F4/80-PE、anti-CD11b-PE-Cy5、anti-IL-12-PE、anti-IL-6-PE、anti-TNF-α-PE 等抗体购自美国 BD 公司；重组小鼠细胞因子 M-CSF 购自美国 Pepro Tech 公司；LPS 购自美国 Sigma 公司；S100A4 ELISA 试剂盒购自美国 Cloud-Clone公司；荧光染料 PKH26、乳胶微球购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养用 PBS 缓冲液冲洗小鼠腹腔取得腹腔灌洗液，将灌洗液 1700 r/min 离心5 min，用含 10% 胎牛血清及 100 U/ml 青霉素和0.1 mg/ml 链霉素的 DMEM 重悬并培养于 37 ℃、5% CO2培养箱中，静置 2 h 后弃上清，底部贴壁细胞为巨噬细胞。取骨髓细胞培养于含 10% 胎牛血清以及 100 U/ml 青霉素和 0.1 mg/ml 链霉素的DMEM 培养液中，加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）50 ng/ml 置于 37 ℃、5% CO2培养箱中，分别于第 3、5、7 天更换培养液，底部贴壁细胞为巨噬细胞。

1.2.2细胞表面分子染色及流式细胞术分析取来自小鼠腹腔巨噬细胞以及骨髓诱导来源巨噬细胞的单个细胞悬液，使每管细胞总数为 5 × 105个/100 μl，每管加入各种抗体 10 μl，轻轻混匀，4 ℃ 避光，静置 30 min。PBS 洗 3 次后，用流式细胞仪检测，应用 FCS Express V3 软件进行分析。

1.2.3ELISA 实验ELISA 试验方法根据制造商的说明进行操作。将 ELISA 板用含 5% BSA 的PBS 在室温下预包被至少 1 h。再用 PBS 洗 3 遍后将标准品和样品加入预包被的 ELISA 板中，室温下孵育 2 ～ 4 h。洗液洗 3 遍之后，在 30 ℃ 的条件下加入特异的细胞因子检测抗体反应 1 h，随后加入 Avidin-HRP A，于 30 ℃ 反应 1 h。在板中加入显色剂，避光显色 10 ～ 20 min 后用终止液终止反应，在 450 nm 测定 OD 值。

1.2.4巨噬细胞吞噬实验将灌洗的腹腔细胞用完全 DMEM 培养液重悬，调整细胞浓度至 2.5 × 106个/ml，以每孔 200 μl 加入 48 孔板，贴壁 2 h后用温 PBS 洗去未贴壁细胞，再加入 100 μl 完全DMEM，再加入 100 μl 不同浓度的 PKH26 标记的鸡红细胞（chicken red blood cell，cRBC）或直径2 μm 带有红色荧光的乳胶微球，培育 2 h 后用温育的 PBS 洗去未吞噬 cRBC 或乳胶微球，用冷PBS 吹下贴壁细胞，流式细胞仪分析巨噬细胞吞噬率。

1.3统计学处理

2　结果

2.1FSP1 在巨噬细胞的表达情况

应用 FSP1-GFP 报告基因小鼠观察巨噬细胞中 FSP1 的表达情况。结果显示，腹腔巨噬细胞约有 50% 细胞表达 FSP1（图1A）。应用 M-CSF 诱导小鼠骨髓前体细胞向巨噬细胞分化，在诱导的3、5、7、9、11 d 分析巨噬细胞中 FSP1 的表达，其中约有 75% 表达 FSP1-GFP（图1B）。无论是腹腔来源还是骨髓来源的巨噬细胞都可以依据 FSP1 的表达情况将其分为 FSP1+和 FSP1-两亚群。

图1　流式细胞仪检测 FSP1 在腹腔巨噬细胞（A）和骨髓来源巨噬细胞（B）的表达情况Figure 1　Expression of FSP1 on peritoneal macrophages （A） and bone marrow derived macrophages （B） detected by flow cytometry

2.2FSP1+巨噬细胞在氧化应激刺激后可以释放FSP1

应用 H2O2（125 μmol/L）分别处理 CD11b+F4/80+巨噬细胞 0 min、20 min、40 min、1 h、3 h 之后流式检测 FSP1 的表达情况，结果表明 FSP1+巨噬细胞中 FSP1+的表达随时间的延长而降低（图2A、B），提示巨噬细胞中表达的 FSP1 可能分泌到胞外。ELISA 检测发现 FSP1 在上清中的浓度确实随时间的延长而增大（图2C）。说明氧化应激诱导剂可以刺激 FSP1+巨噬细胞释放 FSP1蛋白。

图2　氧化应激诱导 FSP1+巨噬细胞释放 FSP1（A：H2O2处理巨噬细胞后流式细胞术检测 FSP1 的表达；B：H2O2处理不同时间后 FSP1+巨噬细胞的比例；C：ELISA 检测上清中 FSP1 的浓度）Figure 2　FSP1+macrophage subset can release FSP1 by oxidative stress induction （A： Expression of FSP1 on macrophages after oxidative stress induction by H2O2； B： Percentage of FSP1+macrophages induced by H2O2； C： Concentration of FSP1 in supernatant detected by ELISA）

2.3FSP1-巨噬细胞与 FSP1+巨噬细胞功能差异比较

为了研究 FSP1-和 FSP1+巨噬细胞在功能上的区别，检测了其细胞因子的分泌水平，结果显示腹腔巨噬细胞（图3A，B）在 LPS 刺激下，IL-6、IL-12、TNF-α 表达水平没有明显差异，荧光强度也没有明显差异。但是检测巨噬细胞对鸡红细胞和乳胶微球的吞噬结果表明，FSP1-巨噬细胞的吞噬能力明显高于 FSP1+巨噬细胞（图4）。因此，FSP1-与 FSP1+巨噬细胞具有相似的炎性因子产生能力，但是 FSP1-巨噬细胞比 FSP1+巨噬细胞具有更强的吞噬功能。

3　讨论

FSP1 是 S100 蛋白家族成员之一，作用于多种细胞，其生物功能主要集中在促进肿瘤的转移方面。S100 蛋白家族只在脊椎动物有表达且具有特异性的表达图谱，主要由 20 多个功能不同的成员组成。S100 蛋白通过与多种靶向蛋白包括酶、细胞骨架蛋白、受体、转录因子和核酸等的相互作用来参与调控细胞的增殖、分化、凋亡、Ca2+平衡、能量代谢、炎症反应、迁移和入侵［11］。有报道证实FSP1 在膀胱癌中有表达，而且可以作为判断远处转移复发以及远处转移存活率的一项标准［12］。在乳腺癌中，FSP1 是由肿瘤细胞或者基质细胞所分泌，通过重塑细胞骨架和增加肿瘤细胞的黏附作用，下调促凋亡相关基因 Bax 的表达和血管生成抑制因子血小板反应蛋白-1 基因的表达并且增加内皮细胞和肿瘤细胞 MMPs 的产生来促进肿瘤的转移［13］。应用 FSP1 阻断抗体 6B12 可以有效抑制原发灶和转移灶内 T 细胞的招募，从而抑制了自发性乳腺癌模型的肿瘤生长和转移［14］。

图3　FSP1-巨噬细胞与 FSP1+巨噬细胞具有相似的分泌细胞因子能力（A：流式分析 FSP1+和 FSP1-巨噬细胞 IL-12、IL-6、TNF-α 的表达情况；B：柱状图显示 FSP1+和 FSP1-巨噬细胞 IL-12、IL-6、TNF-α 的表达情况）Figure 3　FSP1-macrophage subset has similar ability to release inflammatory cytokines compared to FSP1+subset （A： Expression of IL-12、IL-6、TNF-α on FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry； B： Expression of IL-12， IL-6，TNF-α on FSP1+macrophage and FSP1-macrophages）

不仅在肿瘤组织中，在小鼠和大鼠的各个组织器官和细胞中也有 FSP1 的表达，如脾脏、胸腺、骨髓、T 细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞，尤其在腹腔巨噬细胞中表达量最高［15-16］。在自身免疫疾病如银屑病中，FSP1 表达量升高可促进疾病发展［7］。另外，FSP1 促进关节炎患者外周血单核细胞通过TLR4 信号通路的炎性应答反应［8］，而在葡萄球菌感染引起的关节炎模型中，FSP1 敲除导致细菌清除率增加，对于葡萄球菌导致的关节破坏的保护作用也有所增强［17］。有研究表明在肝脏受损后，FSP1可以作为一群具有炎性特征的巨噬细胞的标记，其特点为高表达 COX2、骨调素、多种细胞因子（TNF、IL-1β、IL-6、IL-10）、抑癌蛋白 M 以及多种趋化因子 CCL3、CCL4、CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL10，而下调 MMP3 和 TIMP3 的表达［18］。类似的结果表明，肝脏中 FSP1 是由一群巨噬细胞所分泌并且在肝脏纤维化的进展期通过激活肝星状细胞来促进肝脏纤维化的发展［19］。另外还有研究显示，FSP1+成纤维细胞亚群对胸腺髓质上皮细胞的维持和再生也具有至关重要的作用，FSP1 敲除鼠的胸腺明显减小且胸腺上皮细胞的数量也显著降低［9］。众所周知巨噬细胞是一种广泛分布于全身组织的具有很强可塑性的天然免疫细胞，在天然免疫与适应性免疫以及维持机体的稳态中起到关键作用。相关报道显示，FSP1 敲除后炎症反应对巨噬细胞的趋化作用受损，FSP1 在对巨噬细胞趋化到炎症局部组织这一过程中起关键的调控作用［20］。而 FSP1 对巨噬细胞的其他方面的影响以及机制尚不清楚。因此，本文主要研究巨噬细胞中 FSP1 的表达情况，探讨 FSP1 对天然免疫细胞的生物学作用。为了进一步研究巨噬细胞的 FSP表达情况，应用 FSP1-GFP 小鼠检测了腹腔以及骨髓来源的巨噬细胞中 FSP1 的表达情况，研究发现可以依据巨噬细胞表达 FSP1 的情况将其分为FSP1+以及 FSP1-两群。FSP1+巨噬细胞经过氧化应激诱导剂 H2O2刺激以后，随时间的推移FSP1+巨噬细胞比例降低且可以分泌大量 FSP1蛋白。由于巨噬细胞可以分泌大量促炎性细胞因子参与炎症反应过程，如 IL-6、IL-12、TNF-α 等［21］，因此我们对比检测了 LPS 刺激后两群巨噬细胞对细胞因子的分泌情况的差异，结果显示两群巨噬细胞产生 IL-6、IL-12、TNF-α 的比例并没有显著的变化。而巨噬细胞的另一重要功能是吞噬凋亡细胞及外来病原微生物，在维持机体稳态及免疫应答中发挥重要作用。为了进一步验证这两群巨噬细胞的功能差异对巨噬细胞的吞噬功能进行了检测，结果显示FSP1-巨噬细胞无论是吞噬鸡红细胞还是吞噬乳胶微球的能力均较 FSP1+巨噬细胞有所增强。提示 FSP1 可能抑制巨噬细胞的吞噬能力。

综上所述，FSP1 在腹腔巨噬细胞和骨髓诱导来源的巨噬细胞中都有表达。氧化应激条件下FSP1+巨噬细胞可以分泌大量的 FSP1 蛋白。在功能上，FSP1-巨噬细胞与 FSP1+巨噬细胞有着相似的分泌细胞因子的能力，但是吞噬能力强于 FSP1+巨噬细胞。FSP1 的表达可能会抑制巨噬细胞的吞噬能力。关于 FSP1 在巨噬细胞以及其他天然免疫细胞的表达情况以及其在肿瘤、炎症性疾病和自身免疫性疾病中的生物学意义有待进一步研究。

图4　FSP1-巨噬细胞比 FSP1+巨噬细胞具有更强的吞噬能力（A：流式检测 FSP1-和 FSP1+腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的比例 PEM∶cRBC 为 1∶10；B：折线图显示腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，*P ＜ 0.05；C：流式检测 FSP1-和 FSP1+腹腔巨噬细胞吞噬乳胶微球的比例 PEM∶Beads 为 1∶30；D：折线图显示腹腔巨噬细胞吞噬不同比例乳胶微球的能力，*P ＜0.05）Figure 4　FSP1-macrophage subset had higher phagocytosis ability compared to FSP1+subset（A： Percentage of chicken red blood cells phagocytic by FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry. PEM∶cRBC 1∶10； B： Line chart shows chicken red blood cells phagocytic by peritoneal macrophages，*P ＜ 0.05； C： Percentage of beads phagocytic by FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry PEM ： Beads 1∶30； D： Line chart shows beads phagocytic by peritoneal macrophages，*P ＜ 0.05）

参考文献

［1］ Kimura K， Endo Y， Yonemura Y， et al. Clinical significance of S100A4 and E-cadherin-related adhesion molecules in non-small cell lung cancer. Int J Oncol， 2000， 16（6）：1125-1131.

［2］ Lee WY， Su WC， Lin PW， et al. Expression of S100A4 and Met：potential predictors for metastasis and survival in early-stage breast cancer. Oncology， 2004， 66（6）：429-438.

［3］ Davies BR， O'Donnell M， Durkan GC， et al. Expression of S100A4 protein is associated with metastasis and reduced survival in human bladder cancer. J Pathol， 2002， 196（3）：292-299.

［4］ Matsumoto K， Irie A， Satoh T， et al. Expression of S100A2 and S100A4 predicts for disease progression and patient survival in bladder cancer. Urology， 2007， 70（3）：602-607.

［5］ Chen N， Sato D， Saiki Y， et al. S100A4 is frequently overexpressed in lung cancer cells and promotes cell growth and cell motility. Biochem Biophys Res Commun， 2014， 447（3）：459-464.

［6］ Tsukamoto N， Egawa S， Akada M， et al. The expression of S100A4 in human pancreatic cancer is associated with invasion. Pancreas， 2013，42（6）：1027-1033.

［7］ Zibert JR， Skov L， Thyssen JP， et al. Significance of the S100A4 protein in psoriasis. J Invest Dermatol， 2010， 130（1）：150-160.

［8］ Cerezo LA， Remáková M， Tomčik M， et al. The metastasis-associated protein S100A4 promotes the inflammatory response of mononuclear cells via the TLR4 signalling pathway in rheumatoid arthritis. Rheumatology （Oxford）， 2014， 53（8）：1520-1526.

［9］ Sun L， Sun C， Liang Z， et al. FSP1（+） fibroblast subpopulation is essential for the maintenance and regeneration of medullary thymic epithelial cells. Sci Rep， 2015， 5：14871.

［10］ Klingelhöfer J， Ambartsumian NS， Lukanidin EM. Expression of the metastasis-associated mts1 gene during mouse development. Dev Dyn，1997， 210（2）：87-95.

［11］ Donato R， Cannon B， Sorci G， et al. Functions of S100 proteins. Curr Mol Med， 2013， 13（1）：24-57.

［12］ Agerbaek M， Alsner J， Marcussen N， et al. Focal S100A4 protein expression is an independent predictor of development of metastatic disease in cystectomized bladder cancer patients. Eur Urol， 2006，50（4）：777-785.

［13］ Schmidt-Hansen B， Ornås D， Grigorian M， et al. Extracellular S100A4（mts1） stimulates invasive growth of mouse endothelial cells and modulates MMP-13 matrix metalloproteinase activity. Oncogene，2004， 23（32）：5487-5495.

［14］ Grum-Schwensen B， Klingelhöfer J， Beck M， et al. S100A4-neutralizing antibody suppresses spontaneous tumor progression， pre-metastatic niche formation and alters T-cell polarization balance. BMC Cancer， 2015， 15：44.

［15］ Grigorian MS， Tulchinsky EM， Zain S， et al. The mts1 gene and control of tumor metastasis. Gene， 1993， 135（1-2）：229-238.

［16］ Takenaga K， Nakamura Y， Sakiyama S. Cellular localization of pEL98 protein， an S100-related calcium binding protein， in fibroblasts and its tissue distribution analyzed by monoclonal antibodies. Cell Struct Funct， 1994， 19（3）：133-141.

［17］ Bian L， Strzyz P， Jonsson M， et al. S100A4 deficiency is associated with efficient bacterial clearance and protects against joint destruction during Staphylococcal infection. J Infect Dis， 2011， 204（5）：722-730.

［18］ Österreicher CH， Penz-Österreicher M， Grivennikov SI， et al. Fibroblast-specific protein 1 identifies an inflammatory subpopulation of macrophages in the liver. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108（1）：308-313.

［19］ Chen L， Li J， Zhang J， et al. S100A4 promotes liver fibrosis via activation of hepatic stellate cells. J Hepatol， 2015， 62（1）：156-164.

［20］ Li ZH， Dulyaninova NG， House RP， et al. S100A4 regulates macrophage chemotaxis. Mol Biol Cell， 2010， 21（15）：2598-2610.

［21］ Arango Duque G， Descoteaux A. Macrophage cytokines： involvement in immunity and infectious diseases. Front Immunol， 2014， 5：491.

Author Affiliations: Department of Oncology， the Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Dalian 116001， China （LI Bi-yi， WANG Ruo-yu）； State Key Laboratory of Membrane Biology， Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China （YANG Fan， LI Yang， ZHAO Yong）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):236-241

Expression and function of FSP1 on macrophages

LI Bi-yi， YANG Fan， LI Yang， WANG Ruo-yu， ZHAO Yong

【Abstract】

ObjectiveTo determine the expression of fibroblast-specific protein 1 （FSP1） on macrophages and its roles on macrophage functions.

MethodsFSP1-GFP reporter mice was used in the present study. Macrophages from FSP1-GFP mice were treated with H2O2and the FSP1 expression was detected by flow cytometry and ELISA in protein level. The expressions of cytokines and the phagocytosis on FSP1-or FSP1+macrophages were assayed by flow cytometry.

ResultsPeritoneal macrophages and bone marrow-derived macrophages can be divided into either FSP1+or FSP1-subpopulations. The percentage of FSP1+macrophages was decreased and FSP1 in the supernatant was increased after oxidative stress induction by H2O2stimulation. There was no significant difference between FSP1-and FSP1+macrophages on the expressions of pro-inflammatory cytokines like IL-6， IL-12 and TNF-α after stimulated with LPS. The phagocytosis on chicken red blood cells and latex beads of FSP1-macrophages was higher than FSP1+macrophages.

ConclusionsMacrophages can be divided into two subpopulations depending on the expression of FSP1. FSP1+macrophages can secret abundant FSP1 protein after H2O2stimulation. There is no significant difference between the two subpopulations of macrophages on the secret of cytokines， but FSP1-macrophages own higher phagocytosis ability than FSP1+macrophages.

【Key words】Calcium-binding proteins；Macrophages；Phagocytosis

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.007

通信作者：王若雨，Email：wry1963@sohu.com

收稿日期：2015-12-25

Corresponding Author:WANG Ruo-yu， Email： wry1963@sohu.com