郭勇英,位 庚,李红蓉,田 超,张军芳,高怀林
050000 河北省石家庄市,河北省中医院医务处(郭勇英);河北省络病重点实验室(郭勇英,位庚,李红蓉);河北医科大学研究生学院(位庚,李红蓉);河北以岭医药研究院(田超,张军芳);河北医科大学附属以岭医院内分泌科,河北省中医药络病理论指导糖尿病足防治重点研究室(高怀林)
通心络联合外周血间充质干细胞移植对糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路的影响研究
郭勇英,位 庚,李红蓉,田 超,张军芳,高怀林
050000 河北省石家庄市,河北省中医院医务处(郭勇英);河北省络病重点实验室(郭勇英,位庚,李红蓉);河北医科大学研究生学院(位庚,李红蓉);河北以岭医药研究院(田超,张军芳);河北医科大学附属以岭医院内分泌科,河北省中医药络病理论指导糖尿病足防治重点研究室(高怀林)
【摘要】目的探讨通心络联合外周血间充质干细胞移植对糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响。 方法于2014年3月,选取无特定病原体(SPF级)雄性SD大鼠70只,10只为对照组;60只制作糖尿病足大鼠模型,然后随机分为模型组、西洛他唑组、通心络组、外周血间充质干细胞移植组、西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组、通心络+外周血间充质干细胞移植组各10只。完成相应实验操作28 d后,检测并比较各组大鼠的外周血间充质干细胞及缺血下肢肌组织中的内皮糖蛋白(CD)105、细胞周期蛋白(cyclinD1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)表达水平。结果通心络+外周血间充质干细胞移植组大鼠的干细胞数、积分光密度高于外周血间充质干细胞移植组、西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组,差异有统计学意义(P<0.05);西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组大鼠的干细胞数、积分光密度高于外周血间充质干细胞移植组,差异有统计学意义(P<0.05)。6个造模组大鼠缺血下肢肌组织中CD105、cyclinD1、p-Akt表达水平低于对照组,p-GSK-3β表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);5个用药组大鼠缺血下肢肌组织中CD105、cyclinD1、p-Akt表达水平高于模型组,p-GSK-3β表达水平低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);通心络+外周血间充质干细胞移植组大鼠缺血下肢肌组织中CD105、cyclinD1、p-Akt表达水平高于西洛他唑组、通心络组、外周血间充质干细胞移植组,p-GSK-3β表达水平低于西洛他唑组、通心络组、外周血间充质干细胞移植组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通心络联合外周血间充质干细胞移植可以通过调节PI3K/Akt信号通路,促进内皮细胞增殖、分化,从而促进糖尿病足大鼠的新生血管形成。
【关键词】糖尿病足;通心络;间质干细胞移植;血管生成
郭勇英,位庚,李红蓉,等.通心络联合外周血间充质干细胞移植对糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路的影响研究[J].中国全科医学,2016,19(13):1602-1606.[www.chinagp.net]
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糖尿病足(DF)是糖尿病的严重并发症之一,关键治疗环节为促进缺血状态下治疗性血管新生和有效侧支循环建立,进而改善缺血状态[1]。血管新生是一个较为复杂的过程,可分为早、晚期两个阶段。早期包括血管内皮细胞(VEC)的前体细胞分化、增殖、迁移,融合成初期血管网络;晚期包括血管芽生、分支,形成小血管,血管支持细胞(如平滑肌细胞)分泌、充实在新生血管周围,进而在原有血管基础上形成新的成熟血管[2-3]。本课题组前期研究结果表明,外周血间充质干细胞移植,可以增加糖尿病足大鼠缺血下肢的血流灌注量,促进侧支循环建立[4]。而通心络可以改善糖尿病足大鼠的心肌梗死区微环境,增加干细胞移植后存活率[5],促进血管内皮生长因子(VEGF)表达,增加新生血管和侧支循环建立[6],增加缺血下肢的血流灌注量[4]。本研究旨在探讨通心络联合外周血间充质干细胞移植对糖尿病足大鼠血管新生磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响,以探讨其涉及的分子机制,为糖尿病并发症的临床治疗提供依据。
1材料与方法
1.1实验动物于2014年3月,选取无特定病原体(SPF级)雄性SD大鼠70只,4周龄,体质量190~230 g,由中国食品药品检定研究院提供〔实验动物许可证号:SCX K(京)2009-0017;合格证号:11400500002012〕;另选取清洁级雄性SD大鼠10只,15周龄,体质量300 g左右,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供〔实验动物许可证号:SCXK(京)2012-0001;合格证号:11400700026920〕。
1.2实验室药品及设备(1)药品:通心络原粉(人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成),由石家庄以岭药业股份有限公司提供(生产批号:20120924);西洛他唑片,由浙江大冢制药有限公司提供(生产批号:130801P)。药品配制和保存方法见本课题组前期研究[4]。(2)试剂:链脲佐菌素(STZ)由美国Amresco公司提供(生产批号:1262C443),重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)由深圳新鹏生物工程有限公司提供(生产批号:201302009),细胞处理试剂盒和4、6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)由河北博海生物工程开发有限公司提供(生产批号:20140428、20130808),内皮糖蛋白(CD)90、CD105、CD49A、CD49B、CD49C、CD29、CD104及CD105-荧光素(FITC)、CD44-FITC、CD34-FITC由德国美天旎公司提供(生产批号:30.APR.2013),CD105单克隆抗体、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗吗啡多克隆抗体IgG、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)抗吗啡多克隆抗体IgG、细胞周期蛋白(cyclinD1)兔单克隆抗体均由美国Abcam公司提供(生产批号:ab137875、ab5626、ab75745、ab137875)。(3)设备和器材:AL204精密分析天平由瑞士梅特勒-托利多公司提供,CTR6000荧光显微镜、CM1950型切片机由德国Leica公司提供,干细胞磁性分选架、分选器、分选柱由德国美天旎公司提供,170-930型电转膜仪、170-3940型半干转膜仪、165-8001型垂直电泳仪由美国Bio-Rad公司提供。
1.3方法70只SPF级雄性SD大鼠中,10只为对照组;60只制作糖尿病足大鼠模型,然后随机分为模型组、西洛他唑组、通心络组、外周血间充质干细胞移植组、西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组、通心络+外周血间充质干细胞移植组各10只。
1.3.1模型方法参考文献[5-6],高脂喂养大鼠8周,热量配比为脂肪59.8%,碳水化合物20.1%,蛋白质20.1%;禁食16 h后,造模组以35 mg/kg腹腔注射STZ,对照组注入同体积枸橼酸钠缓冲溶液;以72 h后尾尖血糖>16.7 mmol/L为造模成功。
1.3.2灌胃方法通心络组、通心络+外周血间充质干细胞移植组大鼠以通心络(0.4 g/kg,1 次/d)灌胃,西洛他唑组、西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组大鼠以西洛他唑(18 mg/kg,1 次/d)灌胃,对照组、模型组、外周血间充质干细胞移植组大鼠以等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。
1.3.3手术方法(1)同源异体供体大鼠的外周血间充质干细胞分离方法见课题组前期研究[4]。(2)腹腔注射10.0%水合氯醛进行麻醉;将大鼠仰卧固定,备皮消毒;纵行切开右侧腹股沟正中皮肤,分离腹股沟下股动、静脉,结扎并剪断;创口处局部涂撒青霉素,并进行皮肤缝合。(3)术后3 d,外周血间充质干细胞移植组、西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组、通心络+外周血间充质干细胞移植组大鼠,沿股动脉多点肌肉注射进行干细胞移植(1.0×106/ml),对照组、模型组、通心络组、西洛他唑组大鼠,同点肌肉注射等体积无菌洛斯维(RPMI)-1640培养基。
1.4检测指标及方法
1.4.1外周血间充质干细胞检测术后28 d,取干细胞移植治疗大鼠的肌中段,避光情况下行冷冻切片,厚度为12 μm;室温下干燥1 h,以紫外光激发下干细胞细胞核发出蓝色荧光为DAPI标记成功(见图1)。由实验室人员采用Image-Pro Plus5.0(IPP)图像处理分析软件,计算各组大鼠的干细胞数、荧光强度B、积分光密度[7]。
注:DAPI=4、6-联脒-2-苯基吲哚
图1外周血间充质干细胞的DAPI标记
Figure 1DAPI marking of PB-MSCs
1.4.2CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表达水平检测将大鼠缺血下肢肌组织加入组织裂解液,匀浆;4 ℃下,以8 000 r/min离心10 min,离心半径为10 cm,分离上清液。取各组蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),具体操作方法参照课题组前期研究[4]。蛋白印迹(Western blotting)法检测各组大鼠的CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表达水平,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照。
2结果
2.13组大鼠外周血间充质干细胞检测结果比较3组进行了外周血间充质干细胞移植大鼠的干细胞数、积分光密度比较,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,通心络+外周血间充质干细胞移植组与外周血间充质干细胞移植组、西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组比较,差异有统计学意义(P<0.05);西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组与外周血间充质干细胞移植组比较,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。
2.27组大鼠缺血下肢肌组织中CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表达水平比较7组大鼠缺血下肢肌组织中CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,6个造模组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);模型组与5个用药组比较,差异有统计学意义(P<0.05);通心络+外周血间充质干细胞移植组与西洛他唑组、通心络组、外周血间充质干细胞移植组比较,差异有统计学意义(P<0.05,见表2、图2)。
Table1ComparisonofthedetectionresultsofPB-MSCsamongthethreegroups
组别例数干细胞数(×106/L)荧光强度B积分光密度外周血间充质干细胞移植组1016±4298±3西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组1021±4a2116±6a通心络+外周血间充质干细胞移植组1027±4ab2135±4abF值18.96-168.36P值<0.01-<0.01
注:-代表无此数据;与外周血间充质干细胞移植组比较,aP<0.05;与西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组比较,bP<0.05
Table2ComparisonoftheexpressionlevelsofCD105,cyclinD1,p-Aktandp-GSK-3βinischemiclowerlimbmuscletissueamongthesevengroups
组别例数CD105cyclinD1p-Aktp-GSK-3β对照组100.58±0.031.23±0.051.14±0.040.19±0.04模型组100.08±0.02a0.36±0.01a0.17±0.02a1.12±0.11a西洛他唑组100.32±0.07ab0.47±0.03ab0.67±0.04ab0.68±0.01ab通心络组100.33±0.03ab0.55±0.09abc0.71±0.03ab0.70±0.05ab外周血间充质干细胞移植组100.41±0.01abcd0.63±0.02abcd0.82±0.02abcd0.63±0.06abd西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组100.48±0.02abcde0.89±0.04abcde0.96±0.08abcde0.53±0.01abcde通心络+外周血间充质干细胞移植组100.49±0.02abcde0.93±0.03abcde1.02±0.05abcde0.49±0.03abcdeF值231.83452.30515.85262.36P值<0.01<0.01<0.01<0.01
注:CD105=内皮糖蛋白105,cyclinD1=细胞周期蛋白,p-Akt=磷酸化蛋白激酶B,p-GSK-3β=磷酸化糖原合成酶激酶-3β;与对照组比较,aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05;与西洛他唑组比较,cP<0.05;与通心络组比较,dP<0.05;与外周血间充质干细胞移植组比较,eP<0.05
注:A=对照组,B=模型组,C=通心络组,D=西洛他唑组,E=外周血间充质干细胞移植组,F=通心络+外周血间充质干细胞移植组,G=西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组;CD105=内皮糖蛋白105,cyclinD1=细胞周期蛋白,p-GSK-3β=磷酸化糖原合成酶激酶-3β,p-Akt=磷酸化蛋白激酶B,GAPDH=甘油醛-3-磷酸脱氢酶
图27组大鼠缺血下肢肌组织中CD105、cyclinD1、p-Akt、p-GSK-3β表达
Figure 2Expression of CD105,cyclinD1,p-Akt and p-GSK-3β in ischemic lower limb muscle tissue among the seven groups
3讨论
糖尿病患者存在长期的糖脂代谢紊乱和氧化应激引起的内皮功能损害,导致其血管功能障碍,从而引发动脉粥样硬化,血管壁弹性减弱、管腔阻塞或狭窄,累及下肢远端动脉,最终导致肢体远端血液循环障碍,肢端缺血低氧,形成糖尿病足,严重者甚至可能会出现溃烂、坏疽[8-9]。长期的高血糖状态不仅会导致血管病变,发生严重缺血事件,也会严重损伤侧支血管的形成能力[10]。因此,糖尿病足的临床治疗关键为促进缺血状态下的血管新生和侧支循环形成。
目前,临床上常用的糖尿病足治疗方法有药物治疗、外科手术治疗及血管腔内治疗,但目前尚缺乏对远端流出道严重狭窄患者的有效治疗方法。西洛他唑具有明显的抗血小板聚集和扩张血管作用,可以防止血栓形成和血管闭塞,临床上常被应用于糖尿病足患者的微循环改善治疗。干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞,能产生表现型和基因型与本身完全相同的子细胞。随着干细胞移植技术在再生医学领域的发展,外周血间充质干细胞移植逐渐成为糖尿病足患者的临床治疗新方法。根据干细胞可以分化为血管内皮细胞、形成新生血管的原理,可以将外周血间充质干细胞分离出来,移植到患者的缺血下肢,使其逐渐分化形成新生血管,建立侧支循环,从而改善和恢复缺血下肢血流,达到治疗糖尿病足的目的。
中医学认为,消渴日久,气阴两虚,脉络瘀阻,血行不畅,肢端失养,久病入络,可诱发消渴脱疽。脉络学说对血管病变的防、治均有重要的指导作用,其根据中医脉与血管、脉的分支脉络与中小血管、脉络末端的孙络与微血管、微循环在解剖形态学和生理功能方面的高度相关性,提出了“脉络-血管系统病”概念[11]。糖尿病足是糖尿病日久累及肢体大、中、小、微血管的一类并发症,属中医“消渴脱疽”范畴,故糖尿病足亦属于“脉络-血管系统病”研究范畴。在以脉络“不通”为实质的共性发病机制中,依据“络以通为用”的治疗总则,而通心络是通络药物的代表方药。既往研究结果表明,通心络具有促进鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)和脑缺血后血管新生的作用[12-13]。
血管新生指内皮细胞在原有血管的基础上,出现增殖、迁移、重塑,从而形成新血管的过程[14]。常用标志物包括CD34、CD31、CD105、CD146等。CD105可以调节内皮-间质的信号传递,参与血管生成过程,与泛内皮细胞标志物(如CD31、CD34相关抗原)不同的是,CD105仅在处于增殖状态的血管内皮细胞中高表达,而在正常组织的血管内皮细胞中无或仅有微弱表达[15-17],故其可作为新生血管的重要标志物。本研究结果显示,与对照组比较,模型组大鼠肌组织中的CD105表达明显降低,说明糖尿病足大鼠的新生血管受到抑制,新生血管数量不足。在血管堵塞不易开通的情况下,侧支循环数量减少,新生血管数量不足,血供减少是糖尿病足患者创口不易愈合的重要原因。本研究中,与模型组相比,各用药组大鼠肌组织中的CD105表达水平均升高,且通心络+外周血间充质干细胞移植组大鼠肌组织中的CD105水平高于通心络组、西洛他唑组及外周血间充质干细胞移植组。术后28 d,通心络+外周血间充质干细胞移植组大鼠的干细胞数和积分光密度优于外周血间充质干细胞移植组和西洛他唑+外周血间充质干细胞移植组,说明通心络联合干细胞移植治疗可以增加糖尿病足大鼠的新生血管数量,改善血供情况。
PI3K/Akt信号通路的激活主要发挥抗凋亡、促进内皮细胞增殖、迁移的保护作用,既往研究结果表明,激活的PI3K/Akt信号通路可能在干细胞生长、存活及增殖中扮演重要角色[18-21]。本研究中,与对照组比较,模型组大鼠肌组织中的p-GSK-3β水平较高,p-Akt、cyclinD1水平较低;与模型组比较,各用药组大鼠肌组织中的p-GSK-3β表达水平降低,p-Akt、cyclinD1表达水平升高,且通心络+外周血间充质干细胞移植组大鼠肌组织中p-GSK-3β表达水平较低,cyclinD1、p-Akt表达水平较高。提示通心络联合外周血间充质干细胞移植具有促进糖尿病足大鼠血管新生的作用,其可能是通过激活PI3K/Akt信号通路,上调p-Akt、抑制p-GSK-3β表达,进而上调cyclinD1表达,来促进血管内皮细胞增殖、迁移以及局部缺血区新生血管形成的。
作者贡献:郭勇英进行实验设计与实施、撰写论文、成文并对文章负责;位庚、李红蓉、田超进行实验实施;张军芳进行实验评估、资料收集;高怀林进行质量控制与审校。
本文无利益冲突。
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(本文编辑:王凤微)
Influence of Tongxinluo Combined With Peripheral Blood Derived Mesenchymal Stem Cells Transplantation on the Angiogenesis Through PI3K/Akt Signal Pathway of Diabetic Foot Rats
GUOYong-ying,WEIGeng,LIHong-rong,etal.
MedicalDepartment,HospitalofTraditionalChineseMedicineofHebeiProvince,Shijiazhuang050000,China
【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence of tongxinluo(TXL) combined with peripheral blood derived mesenchymal stem cells(PB-MSCs) transplantation on the angiogenesis through PI3K/Akt signal pathway of diabetic foot rats.MethodsIn March 2014,we selected 70 SPF male SD rats,and assigned 10 rats into control group and built the rest 60 rats into diabetic foot rat models.Then the model rats were randomly divided into 6 groups:model group,cilostazol group,TXL group,PB-MSCs group,TXL combined PB-MSCs(T-MSCs) group and cilostazol combined PB-MSCs(C-MSCs) group,with 10 rats in each group.28 days after the completion of corresponding operation,PB-MSCs and the expression levels of CD105,cyclinD1,p-Akt and p-GSK-3β and in ischemic lower limb muscle tissue were detected and compared.ResultsT-MSCs group was higher than PB-MSCs group and C-MSCs group in the number of PB-MSCs and integral optical density(P<0.05);C-MSCs group was higher than PB-MSCs group in the number of PB-MSCs and integral optical density(P<0.05).The 6 model groups were lower than control group in the expression levels of CD105,cyclinD1,p-Akt,and were higher than control group in the expression level of p-GSK-3β(P<0.05);the 5 groups that were administrated with drugs were higher than model group in the expression levels of CD105,cyclinD1 and p-Akt,but were lower than model group in the expression level of p-GSK-3β(P<0.05);T-MSCs group was higher than cilostazol group,TXL group and PB-MSCs group in the expression levels of CD105,cyclinD1 and p-Akt,and was lower than cilostazol group,TXL group and PB-MSCs group in the expression of p-GSK-3β(P<0.05).ConclusionTXL combined with PB-MSCs transplantation may promote the endothelial cell proliferation and differentiation by regulating PI3K/Akt signaling pathway,thus facilitating the angiogenesis of diabetic foot rats.
【Key words】Diabetic foot;Tongxinluo;Mesenchymal stem cell transplantation;Angiogenesis
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA020115);国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2012CB518606);河北省中医药管理局科研计划项目(2014082)
通信作者:高怀林,050000 河北省石家庄市,河北医科大学附属以岭医院内分泌科,河北省中医药络病理论指导糖尿病足防治重点研究室;E-mail:gaohuailin@126.com
【中图分类号】R 587.29
【文献标识码】A
doi:10.3969/j.issn.1007-9572.2016.13.029
(收稿日期:2016-01-03;修回日期:2016-03-24)
·中医·中西医结合研究·