线粒体病血液氨基酸谱和酰基肉碱谱的改变特点

2016-06-16 01:54:35张哲赵亚雯姚生李毅俞萌刘靖左越焕袁云王朝霞
关键词:串联质谱法氨基酸

张哲 赵亚雯 姚生 李毅 俞萌 刘靖 左越焕 袁云 王朝霞

100034 北京大学第一医院神经内科(张哲、赵亚雯、李毅、俞萌、刘靖、左越焕、袁云、王朝霞);100048 中国人民解放军海军总医院神经内科(姚生)



线粒体病血液氨基酸谱和酰基肉碱谱的改变特点

张哲赵亚雯姚生李毅俞萌刘靖左越焕袁云王朝霞

100034 北京大学第一医院神经内科(张哲、赵亚雯、李毅、俞萌、刘靖、左越焕、袁云、王朝霞);100048 中国人民解放军海军总医院神经内科(姚生)

摘要:目的研究线粒体病患者血液氨基酸谱和酰基肉碱谱的变化特点。方法对50例线粒体病、20例多酰基辅酶A脱氢酶缺陷(MADD)患者和22名健康对照,使用串联质谱法检测血液中氨基酸和酰基肉碱水平。选取线粒体病组与MADD组、健康对照组分别比较差异均有统计学意义(均P<0.05),而MADD组同健康对照组比较差异无统计学意义(P≥0.05)的氨基酸、酰基肉碱相关指标绘制ROC曲线,选取曲线下面积(AUC)最大的指标,计算其诊断线粒体病的敏感度、特异度。结果线粒体病组谷氨酸及鸟氨酸水平分别为中位数89.80 μmol/L、27.70 μmol/L,均低于MADD组(中位数113.46 μmol/L、33.52 μmol/L,均P<0.05)和健康对照组(中位数107.33 μmol/L、34.08 μmol/L,均P<0.001),丙氨酸/谷氨酸比值(中位数2.72)高于MADD组(中位数1.86,P<0.05)和健康对照组(中位数1.55,P<0.001)。线粒体病组乙酰肉碱、羟丁酰肉碱、羟异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、羟棕榈酰肉碱水平分别为中位数27.25 μmol/L、0.28 μmol/L、0.33 μmol/L、0.10 μmol/L、0.08 μmol/L,均高于MADD组(中位数21.32 μmol/L、0.17 μmol/L、0.19 μmol/L、0.09 μmol/L、0.06 μmol/L,均P<0.05)和健康对照组(中位数21.26 μmol/L、0.18 μmol/L、0.20 μmol/L、0.07 μmol/L、0.05 μmol/L,均P<0.01)。对上述氨基酸、酰基肉碱指标绘制ROC曲线,其中丙氨酸/谷氨酸比值AUC 0.864,当丙氨酸/谷氨酸比值>2.17时诊断线粒体病的敏感度和特异度分别为76.00%和85.71%。结论线粒体病的血氨基酸和酰基肉碱改变具有一定规律,有可能作为该类疾病的辅助检查方法。

关键词:串联质谱法;线粒体病;遗传性代谢病;氨基酸; 酰基肉碱。

线粒体病(mitochondrial disease)是由于线粒体基因或核基因突变,线粒体氧化磷酸化功能障碍、腺苷三磷酸(ATP)合成不足导致的一组疾病,肌肉活检、基因检查以及线粒体酶复合体活性测定是诊断线粒体病的金标准。但是该类疾病均有高度的临床异质性,为临床初步诊断带来困难。

为解决线粒体病的临床初步诊断问题,近年来寻找敏感、特异、无创的生物标志物成为国际上线粒体病研究热点。国外学者研究发现线粒体病患者的血液中存在多种氨基酸的改变,血支链氨基酸、支链氨基酸和谷氨酸比值增加[1],血丙氨酸升高[2],这些特点有可能用于线粒体病筛查。目前尚缺乏关于我国线粒体病患者的血氨基酸和酰基肉碱谱分析的报道,为此,本文总结一组国内线粒体病患者血氨基酸和酰基肉碱水平的特点,探讨血氨基酸和酰基肉碱谱检测对线粒体病的诊断价值。

1对象和方法

1.1观察对象 线粒体病组、多酰基辅酶A脱氢酶缺陷(multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency,MADD)组(疾病对照组)均为2009-01-01-2014-12-01年就诊于北京大学第一医院和中国人民解放军海军总医院神经内科的患者。线粒体病组患者50例,男22例、女28例,就诊时年龄5~54岁,平均年龄(23±11.6)岁,均经过基因或肌肉病理检查确诊。其中线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes,MELAS)37例、慢性进行性眼外肌瘫痪(chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO)6例、单纯型线粒体肌病3例、Kearns-Sayer综合征(Kearns-Sayer syndrome,KSS)2例、肌阵挛癫痫伴破碎样红纤维(myoclonic epilepsy with ragged-red fibres,MERRF)1例、MELAS-MERRF-Leigh叠加综合征1例。MADD患者20例,包括男13例、女7例,就诊时年龄12~55岁,平均年龄(38±10.8)岁,其诊断经过血液代谢筛查、肌肉活检和基因检测证实。22名北京大学第一医院的工作人员为健康对照,男10名、女12名,年龄24~36岁,平均年龄(27±2.9)岁,均经定期体检,无症状、体征指向特定疾病,且均无肢体乏力等表现和家族遗传病史。

1.2方法采集所有患者和健康志愿者的空腹外周静脉血,滴在滤纸片上,晾干后于-20℃保存。将干血片送北京摩尔美康实验室,使用串联质谱技术[3]对干血滤纸片分析获得以下物质水平:丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸/异亮氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸,游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、羟丁酰肉碱、异戊酰肉碱、羟异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、戊烯酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、月桂酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱、羟肉豆蔻酰肉碱、肉豆蔻烯酰肉碱、棕榈酰肉碱、羟棕榈酰肉碱、十八碳酰肉碱。

选取上述指标中线粒体病组与MADD组和健康对照组比较差异均有统计学意义,而MADD组同健康对照组比较差异无统计学意义的指标,绘制该指标的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC curve),计算不同指标的曲线下面积(area under the curve,AUC)和诊断切点的比值比(odds ratio,OR),比较诊断价值,并进一步计算AUC最大的指标诊断线粒体病的敏感性、特异性、阳性似然比、阴性似然比。

1.3统计学处理使用SPSS 19.0进行分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示,不符合正态分布的计量资料采用中位数〔上下四分位数间距〕表示。在线粒体病组、MADD组和健康对照组之间各氨基酸、酰基肉碱水平两两比较,采用Mann-WhitneyU检验。以P<0.05为差异有统计学意义。使用MedCalc 12.7绘制该指标的ROC曲线,以Youden指数最大时该指标的值为诊断切点,计算不同指标的曲线下面积(area under the curve,AUC)和诊断切点的OR值,比较诊断价值。根据是否大于切点,将各指标转化为二分类变量,进行二分类Logistic回归分析,选用逐步向前法(依据似然比检验的结果剔除变量)筛选出独立因素。计算AUC最大的指标诊断线粒体病的敏感性、特异性、阳性似然比、阴性似然比。

2结果

2.1血氨基酸谱的特点 各组氨基酸水平结果见表1。与MADD组及健康对照组比较,线粒体病组丙氨酸水平、丙氨酸/谷氨酸比值升高(均P<0.05),谷氨酸、鸟氨酸水平降低(均P<0.05);线粒体病组精氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸水平低于健康对照组(P<0.05);MADD组及健康对照组上述指标比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。线粒体病不同亚型中,MELAS、CPEO丙氨酸/谷氨酸比值中位数(上下四分位数间距)分别为2.74(1.64)、2.43(0.93),均高于MADD组(分别U=118.0,P<0.001;U=31.0,P=0.083)及健康对照组(分别U=79.0,P<0.01;U=17.0,P<0.)。3例线粒体肌病患者丙氨酸/谷氨酸比值分别为2.58、3.04、3.84,2例KSS患者丙氯酸/谷氨酸比值分别为1.56、3.40,MERRF、MELAS-MERRF-Leigh叠加综合征患者丙氨酸/谷氨酸比值分别为3.08、2.14。

2.2血酰基肉碱谱的特点 线粒体病组、MADD组、健康对照组游离肉碱水平分别为32.23(17.71) μmol/L、27.08(17.48) μmol/L、28.60(12.34) μmol/L,三组间两两比较差异均有统计学意义(均P≥0.05)。各组酰基肉碱水平结果见表2。与MADD组及健康对照组比较,线粒体病组乙酰肉碱、羟丁酰肉碱、羟异戊酰肉碱、戊二酰肉碱水平、羟棕榈酰肉碱水平升高(均P<0.05),且MADD组和健康对照之间比较差异无统计学意义;与MADD组及健康对照组比较,癸酰肉碱水平降低(P<0.01),但MADD组和健康对照之间比较差异亦有统计学意义(P<0.01)。

2.3氨基酸谱和酰基肉碱谱的诊断价值 线粒体病组丙氨酸/谷氨酸比值、谷氨酸、鸟氨酸、乙酰肉碱、羟丁酰肉碱、羟异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、羟棕榈酰肉碱水平与MADD组和健康对照组比较差异均有统计学意义,且MADD组上述指标同健康对照组比较差异无统计学意义,故绘制该8个指标的ROC曲线(图1),各指标的AUC、切点、OR值见表3。丙氨酸/谷氨酸比值、羟异戊酰肉碱、鸟氨酸、羟棕榈酰肉碱是诊断线粒体病的独立因素(表4)。当丙氨酸/谷氨酸比值切点取大于2.17〔95%置信区间(confidence intervals,CI:2.09~2.52)〕时,诊断线粒体病的敏感度76.00%(95%CI:61.8%~86.9%),特异度85.71%(95%CI:71.5%~94.6%),阳性似然比5.32(95%CI:2.5~ 11.3),阴性似然比0.28(95%CI:0.2~ 0.5)。

表 1 各组血氨基酸水平比较   〔中位数(上、下四分位数间距),μmol/L〕

注:U1值、P1值:线粒体病组同MADD组比较所得;U2值、P2值:线粒体病组同健康对照组比较所得;U3值、P3值:MADD组同健康对照组比较所得

表 2 各组血酰基肉碱水平比较   〔 中位数(上、下四分位数间距),μmol/L〕

注:U1值、P1值:线粒体病组同MADD组比较所得;U2值、P2值:线粒体病组同健康对照组比较所得;U3值、P3值:MADD组同健康对照组比较所得;线粒体病组:50例;MADD组:20例;健康对照组:22名

表 3 8个指标AUC、切点、Youden指数、OR比较

表 4 线粒体病诊断指标二分类Logistic回归分析结果

图1丙氨酸/谷氨酸比值、谷氨酸、鸟氨酸、乙酰肉碱、羟丁酰肉碱、羟异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、羟棕榈酰肉碱8个指标的ROC曲线比较:丙氨酸/谷氨酸比值的AUC最大(0.864)

3讨论

近年在寻找线粒体病生物标志物的研究中,国外学者发现成纤维细胞生长因子21(FGF21)具有较高的敏感性和特异性[4-5];Kalko等[6]的研究表明生长分化因子15(GDF15)也可能具有成为线粒体病标志物的潜力。但这些检查仅能满足诊断线粒体病的需要,由于该病的罕见性,短期内难以普及,而串联质谱法通过检测血氨基酸和酰基肉碱水平筛查遗传代谢性疾病,已作为一项比较成熟的技术在我国广泛应用[7],因此本研究探讨血氨基酸和酰基肉碱水平筛查线粒体病的价值。

本研究发现,同健康对照比较,线粒体病患者精氨酸水平降低,与国外报道一致[10]。国外学者在此基础上进一步发现补充缺乏的精氨酸能够改善MELAS患者的脑小血管功能异常、细胞代谢,减少卒中样发作的频率[10-11]。谷氨酸是神经元兴奋性递质,线粒体DNA A3243G突变可引起细胞对谷氨酸的摄取减少,可能增加细胞外谷氨酸浓度,加重MELAS患者谷氨酸兴奋性毒性[12]。至于线粒体病患者血谷氨酸减低,对大脑功能有无保护作用,仍然有待进一步研究。

MADD是由于电子转移黄素蛋白(electron transfer flavoprotein,ETF)或ETF脱氢酶(ETF dehydrogenase,ETFDH)缺陷,引起脂肪酸β-氧化过程中产生的还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)向线粒体呼吸链中的泛醌传递电子的过程受阻所致。本研究显示,线粒体病和MADD的代谢缺陷均位于线粒体中,但二者氨基酸谱呈现不同特点,线粒体病患者谷氨酸和鸟氨酸水平低于MADD组,而丙氨酸/谷氨酸比值则高于MADD组,推测出现这种情况的可能原因为MADD呼吸链功能大致正常[13],丙酮酸水平增高不明显,因此不会出现明显的丙氨酸/谷氨酸比值升高。

线粒体病患者血酰基肉碱谱的特点是乙酰肉碱、羟丁酰肉碱、羟异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、羟棕榈酰肉碱水平升高。乙酰肉碱水平升高反映了乙酰CoA蓄积,与线粒体能量代谢异常有关;个别酰基肉碱水平较对照组(包括MADD和健康对照)升高,提示多种脂肪酸代谢异常,可能与线粒体呼吸链功能异常,脂肪酸β-氧化过程障碍导致的脂肪酸转运、利用障碍有关。同时本研究发现,线粒体病升高的酰基肉碱以短链脂酰为主,而MADD以中长链脂酰为主,提示线粒体病与MADD在酰基肉碱谱改变方面也存在一定差异。推测其原因为线粒体病患者呼吸链功能障碍,FADH2传递电子过程也在一定程度上受到影响,所以出现个别酰基肉碱水平升高;MADD患者FADH2传递电子障碍更严重,中长链脂肪酸β-氧化更困难,所以蓄积的酰基肉碱的碳链相对更长。进一步提示二者虽然同为线粒体内代谢异常,但是原发缺陷部位不同造成代谢谱系呈不同的改变。国外学者报道线粒体病患者血液中游离肉碱水平降低[14],但本研究的结果不支持这一点,是否因人群或种族差异所致,尚需进一步扩大样本量分析。

线粒体病氨基酸谱、酰基肉碱谱的改变特点可以作为该类疾病的辅助检查手段。本研究结果显示,有8个指标(丙氨酸/谷氨酸比值、谷氨酸、鸟氨酸、乙酰肉碱、羟丁酰肉碱、羟异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、羟棕榈酰肉碱)在线粒体病与MADD组、健康对照之间差异存在统计学意义,进一步二分类Logistic回归分析结果显示,其中的丙氨酸/谷氨酸比值、羟异戊酰肉碱、鸟氨酸、羟棕榈酰肉碱是指向线粒体病的独立因素,因此被认为具有诊断独立性。本研究结果显示,丙氨酸/谷氨酸比值的AUC(0.864)和OR(15.83)均高于其他指标,当丙氨酸/谷氨酸比值>2.17时诊断线粒体病的敏感度和特异度分别为76.00%和86.36%。

现在广泛应用于线粒体病临床筛查的生物标志物是乳酸、丙酮酸和乳酸/丙酮酸比值,在关于FGF21作为线粒体病生物标志物的研究[4-5]中提及,这3个常用的生物标志物诊断线粒体病的敏感度均偏低,分别为15.09%~52.6%、34.62%~75.0%和11.54%~31.3%,特异度分别为92.8%~98.46%、84.08%~87.2%和98.48%~100.0%。丙氨酸/谷氨酸比值的敏感度明显高于上述指标,提示完善该检查可能有利于提高线粒体病诊断的敏感度。不过,本研究未同时检测乳酸、丙酮酸水平,因而无法直接比较丙氨酸/谷氨酸比值与这些目前常用的检查诊断效果的优劣。

总之,线粒体病具有特征性的血氨基酸和酰基肉碱谱,丙氨酸/谷氨酸比值可以作为线粒体病辅助诊断的生物标志物之一。特别是对非线粒体病诊断和治疗中心的医疗机构而言,可以作为一种辅助检查方法。

志谢:感谢北京大学第一医院医学统计室李雪迎老师在本研究统计学方法上给予的指导。

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(本文编辑:邹晨双)

Blood amino acids and acylcarnitines spectrums in Chinese patients with mitochondrial disease

ZHANGZhe,ZHAOYawen,YAOSheng,LIYi,YUMeng,LIUJing,ZUOYuehuan,YUANYun,WANGZhaoxia*.

*DepartmentofNeurology,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China

ABSTRACT:ObjectiveTo discuss the characteristics of blood amino acids and acylcarnitines spectrums of patients with mitochondrial disease. MethodsLevels of amino acid and acylcarnitines were detected among fifty patients with mitochondrial disease, twenty patients with multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MADD) and twenty-two cases of healthy adult controls by tandem mass spectrometry. The levels of amino acids and acylcarnitines significantly changed in the mitochondrial disease group compared with those in the MADD group and healthy control group(both P<0.05), and not differed between the latter two (P≥0.05).Related indicators of amino acids and acylcarnitines were chosen to draw ROC curves. The item which shared the largest AUC was selected.The sensitivity and specificity were calculated on diagnosing mitochondrial disease. ResultsThe median levels of glutamate and ornithine in patients with mitochondrial disease were 89.80 μmol/L and 27.70 μmol/L, respectively, lower than those in the MADD group(113.46 μmol/L and 33.52 μmol/L, respectively,both P<0.05), and the healthy control group(107.33 μmol/L and 34.08 μmol/L, respectively,both P<0.001). The median level of alanine/glutamate ratio was 2.72 in the mitochondrial disease group, which was higher than that of the MADD group and healthy control group(1.86,1.55, P<0.001, respectively) . The median levels of C2-1, C4OH-1, C5OH-1, C5DC-1 and C16OH-1 were 27.25 μmol/L, 0.28 μmol/L, 0.33 μmol/L, 0.10 μmol/L and 0.08 μmol/L in the mitochondrial disease group, higher than 21.32 μmol/L, 0.17 μmol/L, 0.19 μmol/L, 0.09 μmol/L and 0.06 μmol/L in the MADD group(P<0.05, respectively),and 21.26 μmol/L, 0.18 mol/L, 0.20 μmol/L, 0.07 μmol/L and 0.05 μmol/L in the healthy control group(P<0.01, respectively). The diagnostic sensitivity and specificity of alanine/glutamate ratio (AUC 0.864)>2.17 for mitochondrial disease were 76.00% and 85.71%, respectively. ConclusionsMitochondrial disease has a specific pattern of blood amino acids and acylcarnitines spectrums. Blood amino acids and acylcarnitines spectrums might be a potential biomarker for the diagnosis of mitochondrial disease.

Key words:tandem mass spectrometry; mitochondrial disease; hereditary metabolic disorders; amino acid; acylcarnitine

doi:10.3969/j.issn.1006-2963.2016.02.009

基金项目:科技部十二五重大专项课题(2011ZX09307-001-07);国家自然科学基金资助项目(30870864, 81341040)

通讯作者:王朝霞,Email:drwangzx@163.com

中图分类号:R746.9

文献标识码:A

文章编号:1006-2963 (2016)02-0117-06

Corresponding author:WANG Zhaoxia, Email:drwangzx@163.com.

(收稿日期:2015-03-08)

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