MicroRNA-30与肾脏损伤

郎 月 综述 刘志红 审校

·肾脏病基础·

MicroRNA-30与肾脏损伤

郎 月 综述 刘志红 审校

MicroRNA(miR)是真核动物的一种内源性单链核苷酸，在细胞内起到基因表达的转录后调控作用。micorRNA-30家族由miR-30a～e五个成员组成，不仅在肾脏发育中起重要作用，而且参与了肾脏损伤。miR-30s通过p53、Notch1、钙/钙调磷酸酶通路抑制凋亡与骨架损伤，进而保护足细胞。在肾小管上皮细胞中，miR-30e可调控线粒体的功能，缓解肾间质纤维化。临床分子标志物研究提示，尿miR-30a-5p与原发性局灶节段肾小球硬化患者及原发性肾病综合征患儿疾病活动性相关，并且可预测激素的治疗效果。

microRNA-30 肾脏发育 足细胞损伤 间质纤维化 分子标志物

在肾脏中，microRNA-30(miR-30)是一组具有较高表达量的miR家族，它在肾脏的发育及肾脏病的发生发展中具有重要的作用。本文基于现有的研究结果，总结了miR-30与肾脏发育和损伤之间的关系及其作用机制,重点阐述近年来有关miR-30与足细胞损伤及上下游调控的分子通路。同时，临床研究也提示miR-30作为一种肾脏损伤相关分子标志物具有潜在的临床应用价值。

miR-30家族概述

miR是一种存在于真核细胞中，长约22 nt的内源性非编码单链RNA，通过参与调解下游靶基因翻译过程而发挥其生物学功能。在动物体内，miR经过Drosha酶，exportin-5蛋白及Dicer酶的加工和转运，在胞质中与具有RNA剪切酶活性的Argonaute共同组成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)[1]。通过miR与靶基因mRNA的3’UTR区完全或不完全互补结合，进而引起目的mRNA的降解或翻译停止，在转录后水平起到抑制基因表达的作用[2]。目前已知的人类30%以上的基因受到miR的调控[3]，单个基因同时受到多种miR的调控， miR也可同时调控多种基因的表达，从而在组织或细胞中形成复杂的调控网络。并且，miR在组织器官中的表达有其时间和空间的特点，参与调控器官的发育、结构与功能的维持及疾病的进展[4]。

miR-30家族由miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d及miR-30e五个成员组成(图1)，分别由位于1、6、8三个染色体上的6个基因进行编码。它们之间有较高的同源性，并且在细胞中有一致的表达模式。miR-30广泛地表达于神经元细胞、足细胞、心肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、生殖细胞及部分肿瘤细胞[5]。以往的研究已证实，miR-30可通过调控上皮-间质转化(EMT)相关基因的表达[6-8]，调控胚胎的发育、肿瘤的转移与侵袭[9]及纤维化过程[10-11]。对包含51个实体肿瘤共4 419个样本的miR表达调控进行的研究发现，miR-30处于调控网络的核心位置[12]。提示其在肿瘤的发生发展中具有重要的作用。在肾脏中，miR-30主要表达在足细胞与肾小管上皮细胞[5,13]， 参与了肾脏的发育及肾脏损伤的过程。

图1 成熟miR-30序列miR-30：microRNA-30;阴影部分为miR-30与靶基因3’-UTR区结合的区域

miR-30与肾脏发育

在成年小鼠的肾脏中，miR-30s的表达水平高于胚胎期[5]，提示可能与肾脏发育相关。Agrawal等[14]的研究证实，在胚胎发育后期的非洲爪蟾肾脏中，miR-30家族特异性富集。Lim1是一组同源盒基因，在肾脏发育过程中通过调节肾上皮细胞的分化促进肾管的延长和输尿管芽的分支。miR-30在肾脏发育晚期通过关闭Lim家族转录因子Xlim1/Lhx1的活性，来促进前肾的终末发育形成。并且发现下调miR-30与敲除Dicer 或 Dgcr8最终导致前肾发生几乎相同的损伤表型，即前肾小管数量减少与分化延迟，表明在肾脏发育的过程中，miR-30的时序性表达起到了至关重要的作用。值得注意的是，内源性miR对基因表达的抑制作用只有30%～50%[15]，因此它的功能异常并不能改变分化的进程。

miR-30与足细胞损伤

miR-30是维持足细胞结构和功能的关键调控分子 为了研究miR与足细胞结构和功能之间的关系，Shi等[16]，Harvey等[17]，Jacqueline等[18]分别构建了足细胞特异性Dicer酶敲除鼠，纯合子在出生后平均2～5周开始出现显著的蛋白尿，并且在几周内进展为大量蛋白尿甚至死亡。病理形态学改变为一系列的足细胞损伤表现，包括足细胞特异性分子的缺失，足突融合，足细胞凋亡、丢失，基膜断裂及迅速进展的肾小球硬化，其中以synaptopodin表达下调为最早发生的改变，提示敲除miR的可能最先影响足细胞骨架的结构与稳定。更重要的是，这种损伤是由miR功能缺失直接导致，而非蛋白尿与足突融合事件所致[17]。进一步对肾小球基因表达谱改变的分析发现，从mRNA水平上看，有190个基因发生了显著上调，而应用靶基因预测软件与转录组检测结果进行结合分析提示，miR-30家族调控了其中最多的基因，说明miR-30家族在miR介导的足细胞损伤中具有重要作用。利用临床局灶节段性肾小球硬化(FSGS)大量蛋白尿患者肾活检病理切片进行原位杂交结果显示，miR-30a及miR-30d在肾小球足细胞中特异性表达，并且在FSGS患者中显著下调，提示miR-30家族在足细胞损伤中可能起到保护作用。体外验证中，转化生长因子β(TGF-β)刺激足细胞后引起miR-30a显著下降，并且对其调控的靶蛋白进行了验证，Vim、snail1、Tnrc6a等蛋白均发生了上调，其中，Tnrc6a参与组成细胞胞质P-body元件GW182，参与mRNA的降解与翻译抑制[19]，提示这一过程中可能存在的反馈调节机制，共同参与调控基因的表达。miR-30a在Hela 细胞中过表达也同样会引起蛋白水平的改变，包括与肾脏功能密切相关的分子(如整合素α2)[20]。上述研究证实，miR对维持在足细胞正常功能具有重要作用，其中miR-30可能是非常重要的分子。

miR-30参与足细胞损伤的机制研究 miR-30是通过哪些下游分子机制来介导足细胞损伤的呢？体外足细胞功能的研究提示，miR-30家族可直接靶向抑制Notch1及p53信号通路的活性，从而减少足细胞凋亡[21]。在足细胞损伤过程中，会发生足细胞肌动蛋白减少与骨架的重构。功能学研究也提示，miR-30家族可维持足细胞肌动蛋白骨架的稳定[22]。在足细胞中，钙/钙调磷酸酶信号通路在维持足细胞骨架正常结构与功能中起到重要作用，其中瞬时受体电位通道(TRPC6)的活化导致细胞钙内流增加，钙调磷酸酶活性上调，促进了具有转录因子活性的活化T细胞核因子(NFAT)核转移及Synaptopodin的裂解，导致足细胞下游基因表达的变化与骨架损伤。Wu等[23]在后续的研究中发现， miR-30可直接靶向下调TRPC6、Ppp3ca、Ppp3cb、Ppp3r1、NFATc3从而抑制足细胞钙/钙调磷酸酶通路的活化。损伤条件下，miR-30及钙调磷酸酶抑制剂FK506均可抑制足细胞的钙内流，synaptopodin裂解及细胞凋亡等一系列损伤效应，维持足细胞骨架的形态与功能。同时，miR-30a也可抑制NFATc3的核转位，间接抑制下游尿激酶型纤溶酶原激活物(uPAR)——整合素β3信号通路，在不影响蛋白水平的情况下抑制足细胞膜蛋白整合素β3的活化(图2)[23]。

图2 miR-30介导的足细胞损伤示意图miR-30：microRNA-30;TGF-β：转化生长因子β；GC：糖皮质激素；HDAC3：组蛋白去乙酰化酶3； NCoR Complex：核受体共抑制因子复合体；NFATc3：活化T细胞核因子3；TRPC6：瞬时受体电位通道6；Calcineurin：钙调磷酸酶

miR-30表达水平的变化受多种上游分子所调控。体外TGF-β诱导的足细胞损伤可显著下调miR-30的表达水平[22]。Liu等[24]进一步探讨其机制发现，TGF-β/smad2/3可通过Smad结合元件(SBE)招募组蛋白去乙酰化酶3(Histone 3 Deacetylase，HDAC3)，与NCoR形成转录抑制复合体，降低miR-30d启动子的转录活性，从而下调miR-30d的表达。在组蛋白去乙酰化酶抑制剂(trichostatin,TSA)或HDAC3抑制剂RGFP966的作用下，可逆转TGF-β导致的足细胞骨架的损伤和足细胞凋亡，并且抑制下游信号通路p53及Notch1的活化。此外，在体外培养的血管内皮细胞中，转录因子Krüppel样因子2(Krüppel-like factor 2,KLF2)可上调miR-30的表达，从而抑制E选择素、细胞间黏附分子ICAM、VCAM等一系列促炎因子的表达，起到抗炎作用[25]。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)也可下调miR-30家族的表达水平[23]，这也可能是AngⅡ直接导致足细胞损伤的原因之一。嘌呤霉素大鼠及体外足细胞损伤模型均已证实，糖皮质激素可维持miR-30的表达水平，并且，miR-30参与到糖皮质激素对足细胞的保护作用中[22]。应用生物信息学的方法，使用预测软件miRanda、TargetScan 及PicTar对miR-30a作用的靶基因进行分析，结果提示miR-30均被预测可以靶向作用于糖皮质激素受体。综上可推测糖皮质激素受体与miR-30之间可能存在相互调控关系，其机制有待进一步实验证实。

miR-30与小管-间质损伤

除足细胞外，在肾脏中miR-30也表达于近端小管上皮细胞中，并且参与了肾纤维化的过程。线粒体解偶联蛋白2(UCP2)是一种表达于线粒体内膜上的阴离子转运体。miR-30e可直接靶向作用于UCP2，在小鼠UUO模型及体外TGF-β1肾小管上皮细胞损伤过程中，miR-30e表达的减少直接上调UCP2，从而导致细胞外基质的增多与肾脏纤维化的发生[26]。这一研究结果也提示，除足细胞外，miR-30在肾小管上皮细胞中也具有保护作用。在顺铂诱导的近端肾小管上皮损伤中，miR-30e的水平发生了显著的下调，过表达miR-30e可减少细胞的凋亡及线粒体的损伤[27]。同时，miR-30e也可直接调控snail1基因，影响TGF-β1引起的肾小管EMT(未发表资料)。Gutiérrez-Escolano等[28]对造影剂肾病的分子标志物进行研究。通过碘苯六醇诱导大鼠产生造影剂肾病，并且对血浆及肾组织进行芯片分析，结果提示miR-30a、miR-30c及miR-30e均发生了显著上调。

miR-30作为肾脏损伤临床分子标志物的研究

FSGS是一种以足细胞损伤、足突融合、蛋白尿为主要特征的一组临床病理综合征[29]。Zhang等[30]对活动期及治疗后完全缓解的FSGS患者尿液中分子标志物的研究提示，miR-30a-5p不仅在FSGS患者的尿液中上调，并且，激素治疗敏感的患者在接受治疗8周后显著下降。提示尿液miR-30水平与FSGS疾病活动状态相关。更重要的是，miR-30a-5p基线水平在预测FSGS的治疗反应上具有较高的敏感度和特异度(67.6%，56.3%)。此外，miR-30a-5p在膜性肾病及糖尿病肾病中也发生了上调，但是不能预测激素治疗的效果。上述结果表明，miR-30可能是一种损伤相关的分子标志物，并且可以预测激素的治疗效果。在损伤状态下，miR-30可能通过细胞坏死增加被动释放进入循环和尿液中，也可能是以细胞外囊泡(EV)的形式，在损伤刺激下细胞主动分泌EV的数量增多，其具体的机制有待进一步探索。在另一项研究中，针对微小病变肾病患儿的尿液分子标志物研究中发现，miR-30a-5p在尿液与血液中均发生了显著的上调[31]。此外，miR-30e-5p在糖尿病患者的血清中发生上调[33]。 在肾衰竭患者透析前后，血浆miR-30a的水平与血清肌酐及尿素氮有显著的相关性，提示其可以作为肾衰竭患者评价透析效果的潜在临床指标[33]。

小结:miR-30在肾脏中具有较高的表达量,时序性表达可促进肾脏的发育。在成熟肾脏中，miR-30与足细胞正常的结构和功能维持密切相关。损伤因素可通过下调足细胞miR-30的水平从而导致足细胞骨架的损伤与细胞凋亡。同时，miR-30也参与了小管-间质损伤的过程。临床研究也提示，miR-30可作为肾脏损伤相关的分子标志物，并与激素的疗效相关。

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(本文编辑 青 松 加 则 律 舟)

MicroRNA-30 and kidney injury

LANG Yue，LIU Zhihong

National Clinical Research Center of Kidney diseases,Jinling Hospital,Nanjing University School of Medicine,Nanjing 210016,China

MicroRNA(miR) is a kind of endogenous single strand RNA, which post-transcriptionally regulates gene expression in eukaryocyte. MiR-30 family consists of 5 members, miR-30a through miR-30e. Previous studies revealed that miR-30 played an important role in kidney development as well as renal injury. Mechanism study demonstrated that they could protect podocyte by reducing apoptosis and cytoskeleton damage via inhibiting p53,Notch1 and calcium/calcineurin pathways. Meanwhile, miR-30e ameliorated interstitial fibrosis through regulating mitochondrial function in tubular epithelial cells. Clinical studies also suggested that urine miR-30a-5p could serve as a biomarker of adult FSGS and primary nephrotic syndrome in children, which was correlated with activity of disease and therapeutic effect of glucocorticoids.

microRNA-30 renal development podocyte injury interstitial fibrosis biomarker

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.06.011

国家重点研发计划项目(2016YFC0904100)，江苏省创新能力建设专项(BM2015004)

南京军区南京总医院肾脏科 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

2016-09-03