microRNA-497在肾小球系膜细胞焦亡中的作用及机制

李 嵘 郑昊林 田秀娟 冯世栋 李 莉 于 艳 赵丽娟 周美兰 王汉民

microRNA-497在肾小球系膜细胞焦亡中的作用及机制

李 嵘1郑昊林2田秀娟1冯世栋1李 莉1于 艳1赵丽娟1周美兰1王汉民1

目的：探讨microRNA-497(miR-497)对高糖和胰岛素诱导的肾小球系膜细胞焦亡的调控作用。 方法：高糖和胰岛素处理人肾小球系膜细胞(HRMC)，在不同时间运用流式细胞仪检测细胞焦亡，实时定量PCR检测HRMC细胞中miR-497表达水平；转染不同浓度miR-497 mimic，检测细胞焦亡通路关键基因mRNA表达水平，运用Western印记检测NLRP1蛋白的表达水平；运用生物信息学和萤光素酶报告基因技术预测并验证miR-497对炎性小体NLRP1基因的靶向结合作用；miR-497 mimic和pcDNA-NLRP1分别单独转染或共转染后检测细胞增殖。 结果：高糖和胰岛素处理48 h以上HRMC细胞焦亡水平显著增加(P<0.05)，miR-497表达水平显著降低(P<0.05)；miR-497 mimic转染显著抑制HRMC细胞焦亡，和焦亡通路关键基因IL-1β、TNFα和caspase-1表达水平下降(P<0.05)；miR-497可直接靶向作用于NLRP1基因并抑制NLRP1蛋白的表达；NLRP1过表达可消除miR-497对细胞焦亡的抑制作用。 结论：miR-497 mimic抑制高糖和胰岛素诱导的肾小球系膜细胞焦亡。

细胞焦亡 高糖和胰岛素 microRNA-497 NLRP1炎性小体 半胱氨酸天冬蛋白酶1

肾小球系膜细胞(GMCs)具有收缩、支持、分泌和信息传递等作用[1]。在糖尿病肾病患者体内，高糖和胰岛素环境刺激肾小球系膜细胞发生一些列病理反应包括氧化应激、炎症反应、线粒体损伤及各种类型的细胞坏死和程序性死亡[2]。细胞焦亡是一种新发现的程序性细胞死亡方式，依赖炎性小体调节的半胱氨酸天冬蛋白酶1(caspase-1)裂解激活，并伴随白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等促炎症因子的大量产生[3-4]。

最近研究表明，microRNA(miR)可调控多种糖尿病并发症/合并症组织细胞焦亡的过程[5-7]，对疾病进程有重要影响。最近研究表明miR-497表达水平的下调与早期肾癌的预后不良密切相关[8]，而且miR-497可靶定调节Toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)等转录因子，抑制促炎因子TNF-α和IL-1β的表达，从而起到抗炎的作用细胞焦亡是有特定蛋白符合物(即炎症小体)介导的细胞程序性死亡过程[9]，炎症因子的大量释放是其主要特征之一[10]。然而，miR-497对糖尿病肾病个体肾小球系膜细胞的影响并不清楚。本研究以高糖和胰岛素培养基刺激人肾小球系膜细胞(HRMC)焦亡，探索miR-497在肾小球系膜细胞焦亡过程中的作用和可能的分子机制。研究结果将为糖尿病肾病发病机制的探索和糖尿病肾病的预防和治疗提供实验依据。

材料与方法

主要材料和试剂 HRMC人肾小球系膜细胞株购自上海生命科学研究院细胞资源中心；PBS、青-链霉素、明胶购自天津宝鑫生物；miR-497实时定量PCR引物、miR-497模拟物(miR-497 mimic，即人工合成的miR-497分子)序列(miR-497)和对照模拟物(对照mimic)由广州瑞博公司合成并进行有效性验证；PCR点突变试剂盒购自Takara公司；脂质体3 000转染试剂、人胰岛素、葡萄糖购自Sigma公司1 g/L胰酶溶液、DMEM培养基、胎牛血清等购自Invitrogen公司；总RNA提取试剂盒、总蛋白提取和定量试剂盒、反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技公司；用于细胞焦亡检测的caspase-1活性检测试剂盒和PI染色试剂盒分别购自Bloomington和Life Techology公司；PVDF膜、ECL蛋白检测试剂盒等购自Millipore公司；兔抗小鼠NLRP1多克隆抗体、兔抗小鼠caspase-1多克隆抗体、兔抗小鼠IL-1β多克隆抗体、兔抗小鼠IL-18多克隆抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG购自Abcam公司；细胞培养板、耗材购自Corning公司；实时定量PCR引物包括NLRP1基因、caspase-1基因(Pro-casp1)、IL-1β基因(Pro-IL-1β)和TNFα基因由南京金斯瑞公司设计并合成；pcDNA-NLRP1过表达载体由CellLab公司构建并进行有效性验证；其他试剂均为进口或国产分析纯化。

方法

细胞培养与高糖和胰岛素处理 HRMC细胞培养于37℃、50 ml/L CO2培养箱中。对照组，培养于含4.5 mg/ml葡萄糖的DMEM培养基中；处理组，即高糖、高胰岛素组，培养于含5.4 mg/ml葡萄糖和10 μg/ml胰岛素的DMEM培养基中。细胞每2d换液一次。分别于0h、48h、72h和96h检测对照组和处理组焦亡细胞数目和miR-497表达水平。

miR-497 mimic和载体转染 HRMC细胞接种于高糖和胰岛素培养液中，待细胞汇合至70%左右，运用脂质体3000转染试剂向细胞中转染不同浓度(0、20 nmol/L、40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L、120 nmol/L和150 nmol/L)的miR-497 mimic，加入对照mimic作为对照。分别于0、48和72 h检测转染组和对照组细胞焦亡水平。分别转染对照mimic和80 nmol/L miR-497 mimic，分别于0、48和72 h检测Pro-IL-1β、TNFα和Pro-casp-1基因的mRNA表达水平，以及NLRP1蛋白的表达水平。

HRMC细胞接种于高糖和胰岛素培养液中，待细胞汇合至70%左右，运用脂质体3 000转染试剂向细胞中分别转染对照mimic、80 nmol/L miR-497 mimic、2 μg/mL pcDNA-NLRP1过表达载体以及80 nmol/L miR-497 mimic 2 μg/ml pcDNA-NLRP1 (miR-497+NLRP1)，16h后更换新鲜培养基，分别于0、48h和72h检测各种细胞焦亡数目。

实时定量检测miR-497和NLRP1等基因的mRNA表达水平 运用总RNA提取试剂盒提取细胞中RNA，运用反转录试剂盒进行反转录反应获得cDNA，然后运用实时定量PCR(real-time qPCR)技术检测miR-497、NLRP1、Pro-IL-1β、TNF-α和Pro-casp-1等的表达水平。反应在25 μl体系中进行，体系中包含1 μl的cDNA模板(约200 ng)、上下游引物各0.5 μl(终浓度为0.5 μmol/L)、12.5 μl实时定量PCR反应缓冲液(试剂盒中包含)和10.5 μl双蒸水。反应过程为：95℃预变性2 min,以95℃变性15s、60℃退火延伸55s的条件循环扩增35次，罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪采集信号并分析计算扩增循环数Ct值，以2-ΔΔCt法计算相对表达量。

Western blot法测caspase-1等蛋白水平 处理后收集各组细胞，提取细胞蛋白。蛋白含量测定后，蛋白上样于SDS-PAGE胶中，130V恒压电泳2h；湿转法将蛋白转移至PVDF膜上；室温下以含50 mg/ml脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭PVDF膜1h，裁剪后分别与兔抗小鼠NLRP1抗体(1∶ 300)、兔抗小鼠caspase-1抗体(1∶ 400)、兔抗小鼠IL-1β抗体(1∶ 500)、兔抗小鼠IL-18抗体(1∶ 500)孵育，4℃过夜；TBST清洗膜8 min×4次，加HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶ 1 000)，室温孵育2h；TBST清洗膜8 min×4次，ECL试剂盒检测蛋白表达，于凝胶成像系统中采集图像，重复3次以上，进行统计分析。

细胞焦亡水平检测 分别以caspase-1活性检测试剂盒和PI染色试剂盒标记caspase-1阳性(casp-1+)和PI阳性(PI+)细胞。运用流式细胞术对5×104个标记过的细胞进行筛选，统计双阳性(casp-1+PI+)细胞数目。重复4次以上，并进行统计分析。

萤光素酶报告基因技术验证miR-497对NLRP1的靶向关系 扩增野生型NLRP1 mRNA的3′非翻译区(3′UTR)序列全长，运用PCR点突变试剂盒获得NLRP1 mRNA3′UTR突变体。双酶切胶回收后分别连接于pGL3双萤光素酶报告基因载体上，获得野生型NLRP1-3′UTR报告基因载体(NLRP1-3′UTR-WT)和突变型NLRP1-3′UTR报告基因载体(NLRP1-3′UTR-MUT)；构建好的WT或MUT载体单独或与mimics共同转染于细胞中，72 h后收集细胞，按荧光素酶报告基因试剂盒中所述步骤进行处理，然后在多功能酶标仪中检测萤光素酶活性。

统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件分析处理。测量结果以均数±标准差表示，所有数据两组间比较采用双尾t检验，多组间对比采用ONE-WAY ANOVA方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

高糖和胰岛素诱导人肾小球系膜细胞焦亡并抑制miR-497表达 正常培养基和添加高糖-胰岛素的培养基分别培养HRMC人肾小球系膜细胞株，不同时间点检测细胞增殖水平变化和miR-497的表达水平。如图1A所示，高糖-胰岛素处理48h焦亡细胞数目较对照组无显著变化(P>0.05)，处理72h和96h焦亡细胞数目分别约是对照组的2.5倍和3倍(P<0.05)；如图1B所示，高糖-胰岛素处理48h、72h和96h，miR-497的表达水平均较对照组有显著下降(P<0.05)。

图1 高糖和胰岛素对HRMC焦亡和miR-497表达的影响miR-497:microRNA-497;HRMC:人肾小球系膜细胞；A:高糖和胰岛素处理细胞后不同时间点细胞焦亡数目变化；B:实时定量PCR法检测不同时间点的miR-497表达水平；a：与对照组相比，P<0.05

miR-497转染抑制人肾小球系膜细胞细胞焦亡和促炎症因子基因的表达 高糖-胰岛素处理的HRMC细胞中转染对照mimic和不同浓度的miR-497mimic，不同时间点分别检测细胞焦亡、caspase-1和促炎症因子基因IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平。如图2所示，不同浓度的miR-497mimic处理48 h和72 h，焦亡细胞数目均较对照组显著减少(P<0.05)；随着miR-497mimic浓度增加，抑制细胞焦亡的效果逐渐增强，浓度为80 nmol/L时达到峰值，60、80和100 nmol/L处理组之间无显著差异(P>0.05)。以80 nmol/L miR-497mimic处理48 h和72 h，细胞焦亡关键调控基因caspase-1 mRNA表达水平显著下降(P<0.05，图3A)，IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平也显著下降(P<0.05，图3B和C)，caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的水平也明显下调(图3D)。

图2 不同浓度的miR-497 mimic对HRMC细胞焦亡的影响miR-497:microRNA-497;mimic:模拟物；HRMC：人肾小球系膜细胞；a:与对照组相比，P<0.05;b:与20 nmol/L处理组相比，P<0.05;c:与40 nmol/L处理组相比，P<0.05

图3 miR-497对肾小球系膜细胞焦亡通路关键基因表达的影响miR-497:microRNA-497;mimic:模拟物；A:80 nmol/L miR-497mimic转染后不同时间点caspase-1 mRNA水平的变化；B:miR-497 mimic转染后不同时间点IL-1β mRNA水平的变化；C:miR-497 mimic转染后不同时间点IL-1β mRNA水平的变化；D:miR-497 mimic转染后不同时间点caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白水平的变化水平的变化;C:对照mimic组;T:miR-497 mimic处理组;*:与对照mimic组相比，P<0.05

miR-497直接靶定结合炎性小体NLRP1基因 NLRP1炎性小体在焦亡通路中承担着激活caspase-1的作用[11]。TargetScan预测结果显示miR-497与NLRP1基因的3′UTR(图4A)；萤光素酶报告基因分析结果显示miR-497 mimic可显著降低野生型NLRP1-3′UTR报告基因的萤光素酶活性(P<0.05，图4B)，但对突变型NLRP1-3′UTR报告基因的萤光素酶活性无显著影响(P>0.05，图4B)。Western印记分析结果显示，miR-497可显著抑制NLRP1蛋白的表达(P<0.05，图4C)。

为验证miR-497抑制细胞焦亡是通过靶定炎性小体NLRP1实现，在HRMC人肾小球系膜细胞中分别单独转染miR-497、pcDNA-NLRP1或共转染miR-497和pcDNA-NLRP1，细胞焦亡检测结果显示，pcDNA-NLRP1转染可消除miR-497对细胞焦亡的抑制作用(图5)。

图4 miR-497直接靶定结合炎性小体NLRP1基因并抑制NLRP1蛋白的表达miR-497:microRNA-497;mimic:模拟物；A:TargetScan预测miR-497与NLRP1基因的靶定结合关系；B:萤光素酶报告基因分析验miR-497与NLRP1基因的靶定结合关系；C:转染miR-497 mimic对NLRP1蛋白表达水平的影响;*:miR-497mimic组与mimic对照组荧光素酶活性相比,P<0.05;a:与mimic对照组相比，P<0.05

图5 pcDNA-NLRP1转染可消除miR-497对细胞焦亡的抑制作用miR-497:microRNA-497;mimic:模拟物；a：与mimic对照组相比，P<0.05

讨 论

高糖和胰岛素对肾小球系膜细胞肥大、氧化应激和炎症反应等过程都有一定的作用。最近研究表明，高糖和炎症诱导剂脂多糖共处理导致肾小球系膜细胞内炎性小体水平上升，氧化应激和炎症反应增加[12-13]，是细胞焦亡在分子和亚细胞水平的典型表现，提示高糖和炎症诱导剂共处理可能促进细胞焦亡。本研究中，高糖和胰岛素处理肾小球系膜细胞导致焦亡细胞数目增加，证实高糖和炎症诱导剂胰岛素长时间处理可促进系膜细胞凋亡。

焦亡细胞的典型表现为细胞内炎性小体NLRP1或NLRP3等表达上升，活性caspase-1水平增加及IL-1和TNFα等促炎症因子的大量表达，其鉴定标准为caspase-1表达和PI染色的双阳性[3,14-16]。最近一项研究报道证实，糖尿病肾病个体中caspase-1主导了肾脏组织细胞的损伤[2]，提示细胞焦亡可能是促进肾病糖尿病进程的关键机制。本研究中，高糖和胰岛素处理的肾小球系膜细胞中转染不同浓度的miR-497 mimic后，caspase-1和PI双阳性细胞数目均显著下降。以筛选的最适浓度(80 nmol/L)的miR-497 mimic处理细胞后，细胞中caspase-1、IL-1β和TNFα等标志基因的表达水平显著受到抑制，表明miR-497具有抗细胞焦亡的作用。

众所周知，miRNA的生物学功能决定于其靶基因的具体作用。炎性小体是由细胞内模式识别受体参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分。炎症小体能够识别病原相关分子模式或者宿主来源的危险信号分子，招募和激活促炎症蛋白酶caspase-1，在细胞焦亡的激活过程中起主导作用[17-18]。目前已发现的炎性小体有NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM2[18]。近年来研究表明miRNAs多通过直接或间接调节炎性小体或caspase-1水平调控细胞焦亡。如miR-7和miR-20a等均可通过靶定NLRP3炎性小体抑制神经细胞或心肌细胞的焦亡[19-20]；miR-30d可促进活性caspase-1的表达，促进糖尿病心肌病大鼠心肌细胞的焦亡[21]；miR-9和miR-223则通过间接调节NLRP3炎性小体抑制神经细胞和心肌细胞焦亡[22-23]。然而，调节NLRP1的miRNA的报道并不多见，本研究预测并证实miR-497可直接靶定NLRP1基因并抑制NLRP1蛋白的表达，从而引起抑制高糖和胰岛素诱导的肾小球系膜细胞的焦亡。

综上所述，本研究发现高糖和胰岛素引起肾小球系膜细胞焦亡水平增加并伴随miR-497水平的下调。miR-497可直接靶向结合并抑制NLRP1炎性小体的表达水平，降低细胞中caspase-1表达和促炎症因子的分泌，减少高糖和胰岛素诱导的细胞焦亡和炎症反应。本研究有望为糖尿病肾病的防治研究寻找新的途径。

1 Abboud HE.Mesangial cell biology.Exp Cell Res,2012,318(9):979-985.

2 Yao XM,Ye SD,Xiao CC,et al.Metformin alleviates high glucose mediated oxidative stress in rat glomerular mesangial cells by modulation of p38 mitogen-activated protein kinase expression in vitro.Mol Med Rep,2015,12(1):520-526.

3 Broz P.Immunology:Caspase target drives pyroptosis.Nature,2015,526(7575):642-643.

4 Croker BA,Silke J,Gerlic M.Fight or flight:Regulation of emergency hematopoiesis by pyroptosis and necroptosis.Curr Opin Hematol,2015,22 (4):293-301.

5 Simpson K,Wonnacott A,Fraser DJ,et al.Micrornas in diabetic nephropathy:From biomarkers to therapy.Curr Diab Rep,2016,16(3):35.

6 Kato M,Natarajan R.Micrornas in diabetic nephropathy:Functions,biomarkers,and therapeutic targets.Ann N Y Acad Sci,2015,1353:72-88.

7 Nassirpour R,Raj D,Townsend R,et al.Microrna biomarkers in clinical renal disease:From diabetic nephropathy renal transplantation and beyond.Food Chem Toxicol,2016,98(Pt A):73-88.

8 Zhao X,Zhao Z,Xu W,et al.Down-regulation of miR-497 is associated with poor prognosis in renal cancer.Int J Clin Exp Pathol,2015,8(1):758-764.

9 Xu M,Wang HF,Zhang YY,et al.Protection of rats spinal cord ischemia-reperfusion injury by inhibition of miR-497 on inflammation and apoptosis:Possible role in pediatrics.Biomedical P￣h￣a￣r￣m￣a￣c￣o￣t￣h￣e￣r￣a￣p￣y,2016,81:337-344.

10 Vande Walle L,Lamkanfi M.Pyroptosis.Curr Biol,2016,26(13):R568-572.

11 Masters SL,Gerlic M,Metcalf D,et al.Nlrp1 inflammasome activation induces pyroptosis of hematopoietic progenitor cells.Immunity,2012,37(6):1009-1023.

12 Sakai N,Wada T.Revisiting inflammation in diabetic nephropathy:The role of the nlrp3 inflammasome in glomerular resident cells.Kidney Int.,2015,87(1):12-14.

13 Wada J,Makino H.Innate immunity in diabetes and diabetic nephropathy.Nat Rev Nephrol,2016,12(1):13-26.

14 Abe J,Morrell C.Pyroptosis as a Regulated from of Necrosis:PI+/Annexin V-/High Caspase 1/Low Caspase 9 Activity in Cells=Pyroptosis?Circ Res,2016,118(10):1457-1460.

15 Van Hauwermeiren F,Lamkanfi M.The nek-sus of the nlrp3 i￣n￣f￣l￣a￣m￣m￣a￣s￣o￣m￣e.Nat Immunol,2016,17(3):223-224.

16 Brickler T,Gresham K,Meza A,et al.Nonessential role for the nlrp1 inflammasome complex in a murine model of traumatic brain injury.Mediators Inflamm,2016,2016:6373506.

17 Ali SR,Karin M,Nizet V.Signaling cascades and inflammasome activation in microbial infections.Inflammasome,2015,2(1):7-12.

18 Vanaja SK,Rathinam VA,Fitzgerald KA.Mechanisms of i￣n￣f￣l￣a￣m￣m￣a￣s￣o￣m￣e activation:Recent advances and novel insights.Trends Cell Biol,2015,25(5):308-315.

19 Li XF,Shen WW,Sun YY,et al.Microrna-20a negatively regulates expression of NLRP3-inflammasome by targeting txnip in adjuvant-induced arthritis fibroblast-like synoviocytes.Joint Bone Spine,2016,83(6):695-700.

20 Zhou Y,Lu M,Du RH,et al.MicroRNA-7 targets Nod-like receptor protein 3 inflammasome to modulate neuroinflammation in the pathogenesis of Parkinson’s disease.Mol Neurodegener,2016,11:28.

21 Li X,Du N,Zhang Q,Li J,et al.Microrna-30d regulates cardiomyocyte pyroptosis by directly targeting foxo3a in diabetic cardiomyopathy.Cell Death Dis，2014：5:e1479.

22 Yang Z,Zhong L,Xian R,et al.Microrna-223 regulates inflammation and brain injury via feedback to nlrp3 inflammasome after intracerebral hemorrhage.Mol Immunol,2015,65(2):267-276.

23 Jeyabal P,Thandavarayan RA,Joladarashi D,et al.Microrna-9 inhibits hyperglycemia -induced pyroptosis in human ventricular cardiomyocytes by targeting elavl1.Biochem Biophys Res Commun,2016,471(4):423-429.

(本文编辑 青 松)

Potential role and mechanism of microRNA-497 in the glomerular mesangial cell pyroptosis

LI Rong1,ZHENG Haolin2,TIAN Xiujuan1,FENG Shidong1,LI Li1,YU Yan1,ZHAO Lijuan1,ZHOU Meilan1,WANG Hanmin1

1Department of Nephrology,First Affiliated Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China23rd battalion the nine,grade 2011,Fourth Military Medical University,Xi’an 710032,China

Wang Hanmin(E-mail：whm@medmail.com.cn)

Objective：To explore the potential role and mechanism of microRNA-497 in the glomerular mesangial cell pyroptosis induced by high glucose and insulin. Methodology：High glucose and insulin was used to treat human renal mesangial cells (HRMC). At various time points, cell pyroptosis was detected with flow cytometry, and real-time qPCR was used to detect miR-497 levels in HRMC. Then, various concentrations of miR-497 mimic were transfected to HRMC. The mRNA levels of key genes in pyroptotic pathway, including IL-1β, TNF-α and caspase-1 were detected. Bioinformatics and Luciferase Reporter Gene assay were used to predict and verify the target of miR-497 to nucleotide-binding oligomerization domain receptor P1 (NLRP1) inflammasome. The miR-497 mimic and pcDNA-NLRP1 expression vector were transfected individually or co-transfected to HRMC. Western blotting was used to detect the levels of NLRP1 protein, and cell pyroptosis were detected. Results：HRMC treated with high glucose and insulin for more than 48h, HRMC pyroptosis was significantly increased, and the expression level of miR-497 was decreased (P<0.05). After transfected with miR-497 mimic, the pyroptosis of HRMC was significantly ameliorated, and the mRNA expression of IL-1β, TNFα and caspase-1 were downregulated (P<0.05). miR-497 directly targeted at NLRP1 gene and suppressed NLRP1 protein expression. NLRP1 overexpression completely rescued the inhibition of cell pyroptosis caused by miR-497. Conclusion：The HRMC pyroptosis was suppressed miR-497, and inflammation response was induced by high glucose and insulin.

pyroptosis high glucose and insulin microRNA-497 NLRP1 inflammasome caspase-1

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.06.006

国家自然科学基金(81400699)，陕西省自然科学基金重点项目(2014JZ007)

1第四军医大学西京医院肾内科(西安，710032)；2第四军医大学2011级学员旅三营九连

王汉民(E-mail：whm@medmail.com.cn)

2016-05-18

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