尿液microRNA-196a与肾脏疾病患者远期预后的关系

张昌明 梁少姗 成水芹 王 霞 曾彩虹 郑春霞 刘志红

·论 著·

尿液microRNA-196a与肾脏疾病患者远期预后的关系

张昌明*梁少姗*成水芹 王 霞 曾彩虹 郑春霞 刘志红

目的：探讨尿液microRNA-196a(miR-196a)能否作为预测局灶节段性肾小球硬化(FSGS)远期预后的生物标志物。 方法：收集FSGS患者和正常对照的尿液和血浆标本，分析尿液和血浆miR-196a水平与FSGS活动性的关系。入选231例经肾活检确诊的FSGS，qRT-PCR方法检测尿液miR-196a水平，评估尿液miR-196a对FSGS预后的预测价值。 结果：尿液miR-196a水平在活动性FSGS患者组显著高于肾脏疾病完全缓解组和正常对照组(P<0.001)，血浆miR-196a水平在三组之间无明显差异，表明尿液miR-196a是一种主要来源于肾脏的生物标志物。231例随访患者中，43例进展为终末期肾病(ESRD)。发生ESRD的患者尿液miR-196a水平显著高于未发生ESRD的患者(P=0.025)。尿液miR-196a水平与蛋白尿和估算的肾小球滤过率(eGFR)相关，与肾间质纤维化评分存在相关性。随着尿液miR-196a水平增加，患者发生ESRD的风险增加。校正年龄、性别、蛋白尿、eGFR后尿液miR-196a升高仍是患者进展至ESRD的独立危险因素。 结论：尿液miR-196a是FSGS患者发生ESRD的独立危险因素，可能成为预测FSGS远期预后的新型生物标志物。

局灶节段性肾小球硬化 尿液microRNA-196a 远期预后

慢性肾脏病(CKD)已成为全球性的公共卫生问题，发病率逐年增加[1-3]，其终末期肾病(ESRD)、心血管疾病(CVD)和死亡风险增加[4]。肾间质纤维化是CKD发展至ERSD的共同通路，与CKD进展及预后密切相关[5-8]。肾间质纤维化的评估需要肾穿刺活检才能完成，动态观察肾间质纤维化变化则需要重复肾活检。但肾活检有一定的创伤性，重复活检患者难以接受，因此需要积极寻找无创的生物标志物来评估肾间质纤维化，帮助判断CKD预后。

microRNA(miR)是一组由19～24个碱基组成的小分子非编码RNA，通过与靶基因3’-非翻译区结合从而抑制靶基因翻译或使靶基因降解，参与多种病理生理过程[9]。miR-196a在肾脏表达非常丰富[10-11]，占小鼠各组织器官miR-196a表达总量的74.4%[11]。单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型中miR-196a表达显著下降，外源性补充miR-196a可通过抑制转化生长因子β/Smad(TGF-β-Smad)信号通路而阻止肾间质纤维化，表明miR-196a在肾间质纤维化发生发展过程中发挥重要作用[11]。我们既往研究也发现尿液miR-196a在活动性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者较正常对照显著升高，可用于判断FSGS疾病活动性[12]。基于以上研究背景，我们推测尿液miR-196a水平与FSGS患者肾间质纤维化及远期预后相关。因此本文旨在探讨尿液miR-196a能否作为预测FSGS预后的生物标志物。

对象和方法

病例选择 入选标准：年龄16～65岁，性别不限，经肾活检明确诊断为特发性FSGS。活动性FSGS定义为尿蛋白定量>3.5 g/24h，且血清白蛋白(Alb)<30 g/L；肾脏病完全缓解定义为尿蛋白定量<0.4 g/24h，Alb≥35 g/L，血清肌酐(SCr)≤109.6 μmol/L。排除有明确继发因素(感染、药物、代谢、肿瘤等)、有明确肾脏病家族史的患者。同时选取年龄、性别匹配的正常志愿者作为正常对照。

临床及实验室指标 收集所有入组患者年龄、性别、血压、24h尿蛋白定量、Alb、SCr、总胆固醇、估算的肾小球滤过率(eGFR)采用CKD-EPI公式计算[13]。

肾脏组织病理改变评分 所有肾活检标本均进行光镜(包括HE、PAS、PASM-Masson及Masson三色)、免疫荧光、电镜检查。评估肾间质纤维化时采用Masson三色染色切片，借助数字化图像扫描系统(Aperio ScanScope system)扫描全片，采用Aperio Imagescope软件分析肾间质纤维化的百分比。肾间质纤维化百分比=皮质区Masson绿染面积/皮质区总面积(去除肾小球面积)×100%。所有标本均由不知晓临床结果的病理医生进行评分。

观察终点 ESRD复合终点包括eGFR<15 ml/(min·1.73m2)或开始肾脏替代治疗或肾移植或3年eGFR下降≥40%[14]。

RNA提取及miR-196a检测 所有尿液上清、血浆标本均来自国家肾脏疾病临床医学研究中心生物标本库。每例取300 μl尿液上清、100 μl血浆，采用Trizol LS根据厂商提供的标准操作流程提取总RNA。miR-196a水平采用qRT-PCR方法检测[12,15]。10 μl逆转录体系包括：5×逆转录缓冲液(Takara)2 μl，AMV逆转录酶(Takara)0.5 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)1 μl，茎环逆转录引物(Applied Biosystems)1 μl，RNA 2 μl，DEPC水3.5 μl。反应条件为：16℃，30 min，42℃，30 min，85℃，5 min。所得到的cDNA于-20℃保存备用。20 μl定量PCR体系包括：10×PCR缓冲液(Takara)2 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)0.4 μl，MgCl2(Takara，25 mmol/L)1.2 μl，Taq酶(Takara)0.3 μl，TaqMan探针(Applied Biosystems)0.33 μl，水14.77 μl，cDNA 1 μl。反应条件为：95℃，5 min，然后95℃，15s，60℃，1 min进行40个循环。所有的PCR反应均行3复孔。

统计学分析 利用SPSS 18.0或R软件包对相关数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或One-way Anova检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用卡方检验。受试者工作特征(ROC)曲线分析尿液和血浆miR-196a区分FSGS疾病活动性的能力。Pearson或Spearman相关分析尿液miR-196a与临床及病理指标间的相关性。Kaplan-Meier曲线分析尿液miR-196a水平与肾脏结局之间的关系。单因素和多因素COX回归分析影响肾脏预后的相关风险因素。赤池信息量准则(AIC)及一致性指数(C-index)评估各模型的预测精度。miR-196a水平先进行log10转化后再行上述统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

尿液和血浆miR-196a与FSGS疾病活动性的关系 首先选取正常对照、活动性FSGS和肾脏疾病完全缓解患者各20例(初测阶段)，检测尿液miR-196a水平。结果显示活动性FSGS患者尿液miR-196a水平显著高于正常对照和肾脏疾病完全缓解患者(图1A)。然后选取正常对照、活动性FSGS和肾脏疾病完全缓解患者各80例对上述结果进行验证(验证阶段)，仍然发现，与正常对照和肾脏疾病完全缓解患者相比，活动性FSGS患者尿液miR-196a水平显著升高(图1B)。ROC曲线分析显示尿液miR-196a可以很好的区分活动性FSGS患者和正常对照(图1C)及肾脏疾病完全缓解患者(图1D)。与此同时检测血浆miR-196a水平，结果显示不论是初测阶段，还是验证阶段血浆miR-196a水平在三组间均无明显变化(图1E、F)。血浆miR-196a不能区分活动性FSGS患者和正常对照(图1G)及肾脏疾病完全缓解患者(图1H)。

图1 尿液与血浆miR-196a与疾病活动性的关系miR-196a:microRNA-196a;FSGS：局灶节段性肾小球硬化；NC：正常对照；FSGS-A：活动性FSGS患者； FSGS-CR：肾脏疾病完全缓解患者;A～D：尿液miR-196a与疾病活动性的关系；A：初测阶段FSGS-A患者尿液miR-196a水平显著高于NC和FSGS-CR患者；B：验证阶段FSGS-A患者尿液miR-196a水平显著高于NC和FSGS-CR患者；C：尿液miR-196a能较好的区分FSGS-A患者和NC；D： 尿液miR-196a能较好的区分FSGS-A患者和FSGS-CR患者；E～H：血浆miR-196a与疾病活动性的关系；E：初测阶段FSGS-A患者血浆miR-196a水平与NC和FSGS-CR患者相当；F：验证阶段FSGS-A患者血浆miR-196a水平与NC和FSGS-CR患者相当；G：血浆miR-196a不能区分FSGS-A患者和NC；H：血浆miR-196a不能区分FSGS-A患者和FSGS-CR患者

尿液miR-196a与临床指标的相关性 231例有长期随访数据的FSGS患者，平均年龄为(30.72±13.11)岁，男性比例为68.4%，平均eGFR为(93.54±38.36) ml/(min·1.73m2)，平均随访时间为(56.3±23.5)月，有43例患者进展至ESRD。与未进展至ESRD的患者相比，进展至ESRD的患者基线eGFR水平较低(P=0.007)、尿蛋白水平升高(P=0.016)、SCr水平升高(P=0.010)、尿液miR-196a水平升高(P=0.025)(表1)。年龄、性别、高血压、Alb、总胆固醇水平在两组间无明显差异。相关分析结果显示，尿液miR-196a水平与eGFR、24h尿蛋白定量、Alb、总胆固醇显著相关，与年龄、性别、高血压无相关性(表2)。

尿液miR-196a与肾间质纤维化的关系 为了探讨尿液miR-196a水平与肾间质纤维化的相关性，我们使用数字化图像扫描系统计算了每例患者的肾间质纤维化百分比。Pearson相关分析结果显示，尿液miR-196a水平与肾间质纤维化百分比显著正相关(图2)，与肾小球节段硬化、肾小球球性硬化无相关性(r=-0.099和0.069，P=0.135和0.299)。

表1 231例随访研究患者的基线临床和病理资料

eGFR：估算的肾小球滤过率;ESRD:终末期肾病；miRNA-196a:microRNA-196a

表2 尿液miRNA-196a与临床指标相关性

eGFR：估算的肾小球滤过率；miRNA-196a:microRNA-196a

图2 尿液microRNA-196a水平与肾间质纤维化正相关

尿液miR-196a对FSGS患者肾脏远期预后的预测 以正常对照组尿液miR-196a水平的95%分位数上限(2.67)为参考值，将FSGS患者分为两组：尿液miR-196a水平升高组(尿液miR-196a>2.67)和尿液miR-196a水平正常组(尿液miR-196a<2.67)。尿液miR-196a水平升高组，5年和10年累积肾存活率分别为77.5%和73.0%。尿液miR-196a水平正常组，5年和10年累积肾存活率分别为90.0%和89.2%。Kaplan-Meier生存曲线显示，尿液miR-196a水平升高组患者ESRD累积发生率增加(图3)。

图3 Kaplan-Meier曲线分析不同尿液microRNA-196a水平的肾存活率

单因素COX回归分析显示，尿液miR-196a水平升高组较尿液miR-196a水平正常组ESRD发生风险增加，HR=2.43(95%CI 1.27～4.66；P=0.008)。校正年龄、性别、尿蛋白、eGFR等影响因素后，尿液miR-196a水平升高仍然是ESRD发生风险增加的独立危险因素(表3)。

表3 尿液miR-196a预测ESRD的单因素及多因素COX回归分析

HR95%CIP值单因素COX模型尿液miR-196a(log10转化)1.611.01～2.570.045尿液miR-196a分组2.431.27～4.660.008多因素COX模型*尿液miR-196a(log10转化)1.590.96～2.640.074尿液miR-196a分组2.111.09～4.070.027

miR-196a：microRNA-196a; ESRD:终末期肾病；eGFR：估算的肾小球滤过率；*：对年龄、性别、eGFR和蛋白尿进行校正

以eGFR和蛋白尿为预测因子(校正年龄、性别)，构建FSGS预后的基础预测模型(模型1，M1)，再以eGFR、蛋白尿和尿液miR-196a分组为预测因子(校正年龄、性别)，构建FSGS预后的新模型(模型2，M2)。计算两个模型的AIC和C-index值，结果显示：与M1相比，加入尿液miR-196a分组的模型M2的AIC从433降至429，C-index从0.65提高到0.68(P=0.021)，表明加入尿液miR-196a分组后的新模型对FSGS预后的预测精度优于基础预测模型。

讨 论

本研究发现，尿液miR-196a是一种肾脏来源的生物标志物，其表达水平与肾间质纤维化程度相关，可以帮助预测FSGS远期预后，拓宽了体液miRNAs检测在肾脏疾病领域的潜在应用价值。

本研究通过分析尿液miR-196a水平与FSGS患者远期预后的关系，发现FSGS患者尿液miR-196a水平与肾间质纤维化、基线eGFR和蛋白尿相关，尿液miR-196a水平升高的患者ESRD累积发生率增加，校正年龄、性别、eGFR和蛋白尿等影响因素后尿液miR-196a升高仍是ESRD发生风险增加的独立危险因素，为临床医师判断患者的远期预后提供了一种新的、无创的生物标志物。这组患者经肾活检明确诊断、随访时间长(未进展至ESRD的患者至少随访3年)、临床资料完整，能较好的保证研究结果的可靠性。

尿液miR-196a可能源于血液中miR-196a的超负荷或者损伤的肾脏组织。为了探寻这一问题，我们同时检测了FSGS患者与正常对照尿液和血浆miR-196a水平，发现活动性FSGS患者尿液miR-196a较完全缓解患者和正常对照显著升高，与疾病活动性相关。但是，无论是活动性FSGS患者，还是肾脏病完全缓解患者，血浆miR-196a水平较正常对照均无升高，血浆miR-196a水平与FSGS疾病活动性没有相关性。这一结果表明尿液miR-196a水平的升高并非由于血液中miR-196a的超负荷，而很可能源自于损伤的肾脏。

miR-196a在细胞生物合成、代谢调控过程中发挥重要作用。如研究发现miR-196a可通过调控细胞外基质成分I型胶原的表达参与硬皮病的发生[16-17]，Kashiyama 等[18]发现miR-196a可同时调控细胞外基质成分Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达参与瘢痕疙瘩的形成。细胞外基质也是肾组织的重要组成成分，miR-196a也可通过对肾脏基质的调节而参与肾脏疾病如肾脏纤维化的发生发展，如Meng等[11]发现正常肾脏中miR-196a表达丰富，占各脏器miR-196a总量的74.4%。UUO诱导的纤维化小鼠模型中miR-196a表达下调，通过上调靶基因TGF-β受体2(TGF-βR2)表达，激活TGF-β-Smad信号通路，促进Ⅰ型胶原分泌，从而参与肾脏纤维化的发生发展。本研究发现，尿液miR-196a和肾间质纤维化显著正相关，表明尿液miR-196a可能反映了肾小管间质的病理生理变化，为其预测FSGS预后提供了分子基础。有研究认为肾小球硬化是影响FSGS预后的危险因素之一[19]，但本文发现尿液miR-196a与肾小球硬化并无相关性。尽管肾小球中miR-196a表达也很丰富[11]，但是肾小球损伤情况下miR-196a变化情况及miR-196a在肾小球损伤中的作用尚无相关研究，FSGS患者尿液miR-196a的变化与肾小球特别是足细胞中miR-196a水平的变化是否有关还需进一步研究。FSGS患者肾小球和肾小管间质中miR-196a表达水平、其与肾脏纤维化和FSGS远期预后的相关性等问题亦有待进一步研究。

大量研究均证实肾间质纤维化与CKD患者预后不良相关[6-8]，提示尿液miR-196a可能可以预测多种CKD患者的远期预后。我们既往的研究也发现除了FSGS，在膜性肾病(MN)和糖尿病肾病(DN)患者尿液中亦可检测到miR-196a的升高[12]，表明miR-196a并不是一种疾病特异的标志物，而是一种损伤相关的标志物，尿液miR-196a能否预测MN和DN的远期预后是我们即将开展的工作。此外研究表明 TGF-β和盘状结构域受体2(DDR2)可以抑制成纤维细胞中miR-196a的表达[16,17]，寒冷刺激或β肾上腺素可诱导白色脂肪组织前体细胞中miR-196a的表达[20]，但是肾组织及尿液miR-196a表达调控的机制尚无相关研究，进一步阐明调控miR-196a表达的机制可以为肾脏疾病的治疗提供新靶点，从而改善患者远期预后。

综上所述，尿液miR-196a和FSGS患者肾间质纤维化显著相关，且是ESRD发生的独立危险因素，可能成为预测FSGS远期预后的新型生物标志物。

(致谢：本研究使用的血浆和尿液标本来自于国家肾脏疾病临床医学研究中心生物样本库)

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(本文编辑 莫 非)

Urinary microRNA-196a as a predictor of long-term outcome in patients with kidney disease

ZHANG Changming*,LIANG Shaoshan*,CHENG Shuiqin,WANG Xia,ZENG Caihong,ZHENG Chunxia,LIU Zhihong

National Clinical Research Center of Kidney Diseases,Jinling Hospital,Nanjing University School of Medicine,Nanjing 210016,China

*ZHANG Changming and LIANG Shaoshan are considered to be first authors

LIU Zhihong(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

Objective： To investigate the association between urinary microRNA-196a (miR-196a) and long-term outcome in patients with focal segmental glomerulosclerosis(FSGS). Methodology：Urinary and plasma miR-196a were tested in patients with active FSGS(FSGS-A), FSGS in complete remission(FSGS-CR) and normal controls(NC). 231 FSGS patients were then enrolled at the time of renal biopsy and urinary miR-196a levels were measured by qRT-PCR. The relationship between urinary miR-196a and long-term outcome of FSGS was analyzed. Results：Urinary miR-196a levels were significantly increased in FSGS-A patients as compared with FSGS-CR patients and NCs(P<0.001). However, plasma miR-196a levels showed no difference among the three groups, suggesting that the change of urinary miR-196a was mainly kidney derived. Of the 231 patients, 43 patients developed end-stage renal disease(ESRD) during the follow-up period. Urinary miR-196a levels were significantly higher in patients who progressed to ESRD than those not progressed to ESRD(P=0.025). Urinary miR-196a was associated with proteinuria, eGFR, and interstitial fibrosis. Patients with higher urinary miR-196a levels had a higher cumulative incidence of ESRD. Risk persisted after adjusting for age, sex, proteinuria, and eGFR. Conclusion：Urinary miR-196a is an independent risk factor of ESRD, facilitating early identification of those who will subsequently develop ESRD.

focal segmental glomerulosclerosis urinary miR-196a long-term renal survival

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.06.001

国家重点研发计划项目(2016YFC0904100)，国家科技支撑计划课题(2015BAI12B05)，第一批国家临床重点专科项目(2014ZDZK001)，江苏省创新能力建设专项(BM2015004)，国家自然科学基金(81570644),南京军区南京总医院院管课题(2014003)

南京军区南京总医院肾脏科 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016),*张昌明和梁少姗为共同第一作者

刘志红(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

2016-10-27

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