CAPE-NO2预处理对CCl4引起的小鼠肝损伤的保护作用*

游　莉，董　志，路晓钦

(1.西南大学医院药剂科，重庆 400715；2.重庆医科大学药学院，重庆 400016；3.重庆市第九人民医院药剂科，重庆 400700)



CAPE-NO2预处理对CCl4引起的小鼠肝损伤的保护作用*

游莉1，董志2△，路晓钦3

(1.西南大学医院药剂科，重庆 400715；2.重庆医科大学药学院，重庆 400016；3.重庆市第九人民医院药剂科，重庆 400700)

[摘要]目的研究对硝基咖啡酸苯乙酯(CAPE-NO2)对CCl4诱导的小鼠化学性肝损伤的保护作用。方法小鼠分为7组，每组10只。分组：正常组，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)组，模型组，CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4组，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4组，CAPE-NO2(1.0 mg/kg)+ CCl4组，CAPE-NO2(0.5 mg/kg)+ CCl4组。各组腹腔注射给药15 d，正常组和模型组给生理盐水0.1 mL/10 g。第15天给药结束后，正常组和CAPE-NO2组腹腔注射橄榄油溶液(0.1 mL/10g)，其余各组腹腔注射0.15%CCl4橄榄油溶液(0.1 mL/10 g)。测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性、三酰甘油(TG)水平，肝组织匀浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、过氧化氢酶(CAT)活性。取肝左叶经10%多聚甲醛固定，进行组织病理学检查和TUNEL染色。结果CAPE-NO2能显著降低CCl4诱导的肝损伤小鼠血清ALT、AST活性、TG水平，升高小鼠肝组织中CAT、GSH-Px的活性，且呈药效剂量依赖性。CAPE-NO2能明显减少肝细胞损伤和降低肝细胞凋亡率，且作用强于CAPE。结论CAPE-NO2对小鼠化学性肝损伤具有一定的保护作用，机制可能与增强肝细胞抗氧酶的水平，提高机体清除自由基能力和抑制细胞凋亡有关。

[关键词]肝；损伤；四氯化碳；对硝基咖啡酸苯乙酯；保护作用

咖啡酸苯乙酯(CAPE)是蜂胶中的一种主要活性组分，属于多酚类化合物，是一种强抗氧化剂，有清除自由基的功效。在抗氧化[1]、延迟肝纤维化[2]、保护由CCl4诱导的肝损伤[3]和阻止甲氨蝶呤引起的肝肾氧化损伤[4]等方面表现出独特的药理作用。前期有实验研究，通过对CAPE邻二羟基进行修饰，得到咖啡酸苯乙酯的一种衍生物，即对硝基咖啡酸苯乙酯(CAPE-NO2)，显示出比咖啡酸苯乙酯更强的抗氧化和免疫调节作用[5]。本文采用CCl4所致小鼠肝损伤模型，研究CAPE-NO2对肝损伤的保护作用及其可能的作用机制，为寻找有效的抗氧化物质治疗肝脏疾病提供药理学基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康昆明小鼠70只，雄性，体质量(20±2)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SCXK(渝)2007-0006。

1.1.2药品及试剂CAPE-NO2由西南大学药学院药理教研室提供；四氯化碳(CCl4)，成都市科龙化工试剂厂，批号20100925；市售橄榄油；谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、三酰甘油(TG)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、考马斯亮蓝检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；TG试剂盒为上海继锦化学科技有限公司产品。

表1　CAPE-NO2对CCl4致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST 和TG的影响

a：P<0.01，与正常组比较；b：P<0.01，与模型组比较；c：P<0.01，与CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4组比较。

A:正常组；B:CAPE-NO2(2.0 mg/kg)组;C:模型组；D:CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4组；E:CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4组。

图1小鼠肝脏病理切片(HE×200)

1.1.3仪器JY92．2D型超声波细粉碎机(宁波新芝科器研究所)；1901型双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；组织匀浆机(江苏麒麟贝尔)；LEICA2135 转速切片机(德国LEICA公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组和给药小鼠分为7组，每组10只。分组：正常组，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)组，模型组，CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4组，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4组，CAPE-NO2(1.0 mg/kg)+ CCl4组，CAPE-NO2(0.5 mg/kg)+ CCl4组。各组腹腔注射给药15 d，正常组和模型组给生理盐水0.1 mL/10g。第15天给药结束后，正常组和CAPE-NO2组腹腔注射橄榄油溶液(0.1 mL/10 g)，其余各组腹腔注射0.15%CCl4橄榄油溶液(0.1 mL/10 g)，禁食，16 h后心脏采血，并分离小鼠肝脏，检测各项生化指标。

1.2.2肝组织匀浆制备及其酶学指标测量小鼠血样4 ℃ 3 500 r/min离心10 min，取血清，自动生化分析仪检测血清ALT、AST和TG的活性。腹腔分离肝脏，用冰生理盐水洗去多余血渍等，用滤纸拭干，天平称质量，以体积质量比= 9∶1置于冷冻的生理盐水中，制备10%肝组织匀浆，将匀浆置于4 ℃冷冻离心机离心(4 000 r/min，10 min)。取出上清液，按照试剂盒说明书进行GSH-Px和CAT水平测定。

1.2.3肝脏组织的病理切片观察用4 ℃生理盐水冲洗肝脏后，滤纸吸干，取距肝左叶边缘0.5 cm处同一部位的一小块肝组织，于10%多聚甲醛固定液中固定，石蜡包埋，常规切片，苏木素-伊红(HE)染色，封片后，光学显微镜观察肝组织的病理形态学变化。

1.2.4组织凋亡检查(TUNEL染色)取肝左叶经10%多聚甲醛固定采用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法按试剂盒说明书进行。显微镜(×200)观察，拍摄图谱，用Image-ProPlus 6.0分析凋亡率。

2结果

2.1CAPE-NO2对ALT、AST和TG的影响与模型组比，CAPE-NO2各剂量组均能显著降低CCl4所引起的ALT、AST、TG的升高(P<0.01)，且具有浓度依赖性。CAPE-NO2(2.0 mg/kg、1.0 mg/kg)降低作用与CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.2CAPE-NO2对GSH-Px活性和CAT活性的影响与模型组比，CAPE-NO2各剂量组均能显著升高GSH-Px与CAT在血清中的水平，且具有浓度依赖性。CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+CCl4升高作用明显优于同剂量的CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4组，见表2。

2.3CAPE-NO2对组织病理变化的影响显微镜观察各组小鼠肝组织，正常组和CAPE-NO2组肝组织结构正常，肝索排列整齐，无水肿、无脂肪变性，见图1。模型组小鼠肝组织可见肝细胞明显的脂肪变性，细胞内形成脂滴，可见小泡性脂变，细胞核固缩较严重；胞质解离，可见炎症细胞浸润。CAPE(2.0 mg/kg) + CCl4组症状较模型组有所减轻，但肝细胞仍可见明显气球样变；CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+CCl4组仅在中央静脉周围有脂肪变性，肝细胞排列较整齐，结构完整。

2.4CAPE-NO2对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏组织细胞凋亡的影响用TUNEL法检测各组小鼠肝组织细胞凋亡情况。正常组和CAPE-NO2(2.0 mg/kg)组细胞显蓝色，小鼠肝组织凋亡细胞较少。模型组经DAB显色阳性细胞呈棕黄色，表明大量的细胞凋亡，与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+CCl4组的凋亡细胞明显减少(P<0.01)，与同剂量的CAPE相比CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4组肝组织细胞凋亡率更低(P<0.01)，见图2。

表2　肝组织中GSH-Px与CAT活性的变化

a：P<0.01，与正常组比较；b：P<0.05，c：P<0.01,与模型组比较；d：P<0.05，与CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4组比较。

A:正常组；B:CAPE-NO2(2.0 mg/kg)组；C:模型组；D:CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4组；E:CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4组;a：P<0.01，与正常组比较；b：P<0.01，与模型组比较；c：P<0.01，与CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4组比较。

图2CAPE-NO2对CCl4所致肝损伤小鼠肝细胞凋亡的DAB染色(×200)

3讨论

肝损伤是由多种因素参与的复杂过程，当肝脏内自由基的产生和清除的动态平衡被打破后，会产生大量过剩自由基，将会导致肝细胞大小膜泡的形成、膜通透性流动性丧失、DNA损伤及诱发细胞凋亡，在造成肝损伤同时氧自由基也可以促进肝星状细胞(HSC)的增殖和胶原合成，促进肝纤维化形成[6-9]。

肝细胞膜的结构和功能损伤后，胞内的转氨酶ALT、AST溢出，使血浆ALT、AST升高[10]，这在一定程度上反映了肝细胞的损伤程度，因此血浆ALT、AST升高被认为是判断急性肝损伤严重程度的重要指标[11]。有研究表明，CAPE对CCl4所诱引的化学性肝损伤具有保护作用，明显降低CCl4等复合因素诱导大鼠肝损伤的ALT和AST水平[12]。本研究中，CAPE-NO2对ALT、AST和TG无显著影响，表明CAPE-NO2本身不对肝组织造成损伤。CAPE-NO2可使CCl4诱导的肝损伤小鼠血清ALT、AST和TG水平显著下降，且有明显的药物量效关系。且CAPE-NO2(2.0 mg/kg、1.0 mg/kg)对ALT、AST和TG的降低作用优于CAPE(2.0 mg/kg)。研究表明，CCl4肝损伤早期肝脏CAT活性降低。GSH-Px催化GSH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用[13]；GSH-Px和CAT能与SOD等酶相互配合，最终可起到预防肝损伤或修复肝损伤的作用[14]。有研究表明，CAPE明显升高肝损伤大鼠GSH水平和增加CAT活力[15]。本研究中，CAPE-NO2和CAPE均能显著升高由CCl4引起的GSH-Px和CAT水平下降，且CAPE-NO2升高作用更加显著，表明CAPE-NO2能提高细胞清除自由基的能力，减轻自由基对肝细胞攻击发生的损伤，CCl4急性肝损伤模型组小鼠肝脏HE染色可见肝细胞坏死、肝细胞肿胀、细胞核固缩、核溶解等变化并伴有炎症细胞浸润等病理改变。CAPE-NO2对肝损伤保护效果较CAPE更好。凋亡是正常细胞现象，但也可被许多外部因素激发，肝细胞凋亡发生在肝发育和成人肝的肝细胞更新时，也发生在各种病毒、免疫、肿瘤和药物引起的肝脏疾病。实验中可见TUNEL阳性细胞核染成棕色，与周围肝细胞比，体积缩小、核固缩明显。CAPE-NO2与同剂量的CAPE比较，CAPE-NO2具有更强的抗肝细胞凋亡能力。

综上所述，CAPE-NO2可使CCl4肝损伤小鼠血清ALT、AST和TG水平显著下降，可通过增强肝细胞抗氧酶的水平提高机体清除自由基能力，减少肝细胞凋亡，从而减轻肝脏的病理损伤。作为一种半合成、具有邻二酚羟基化学结构的CAPE-NO2对化学性肝损伤具有明确的保护作用，预示了其在防治肝细胞损伤等疾病中的应用前景，具有开发利用成为肝脏保护剂的可能。

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Protective effect of p-nitro caffeic acid phernethyl ester on liver injury induced by CCl4in mice*

YouLi1，DongZhi2△，LuXiaoqin3

(1.DepartmentofPharmacy,SouthwestUniversityHospital，Chongqing400715，China；2.CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China；3.DepartmentofPharmacy，ChongqingNinthPeople′sHospital，Chongqing400700，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect of p-nitro caffeic acid phernethyl ester(CAPE-NO2) pretreatment on liver injury induced by CCl4 in mice.MethodsA total of 70 mice were divided into 7 groups,normal group,CAPE-NO2(2.0 mg/kg) group,model group,CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4 group,CAPE-NO2(1.0 mg/kg) group+CCl4 group and CAPE-NO2(0.5 mg/kg)+CCl4 group.Each group was given the intraperitoneal medication for 15 d.Normal saline 0.1 mL/10 g was given in the normal group and the model group.After15 d medication,the normal group and the CAPE-NO2 group were itraperitoneally injected by olive oil solution 0.1 mL/10 g,the other groups by 0.15% CCI4-olive oil solution(0.1 mL/10 g).The serum ALT,AST and TG levels and GSH-Px activity and CAT activity in liver homogenate were measured.The left hepatic lobe was taken and fixed by 10%paraformaldehyde for conducting the histopathological examination and TUNEL staining.ResultsCAPE-NO2 could significantly reduce serum ALT and AST activities and TG level in mice with CCl4 induced liver damage,and increased the CAT and GSH-Px activities in liver tissue with a dose-dependent manner.CAPE-NO2 could significantly reduce the hepatocellular injury and decreased the hepatocellular apoptosis rate,moreover its effect was stronger than that of CAPE.ConclusionCAPE-NO2 has certain protective effect on mice chemical liver injury,its mechanism might be associated with enhancing the antioxidase level of liver cells and increase the capability for scavenging free radicals and inhibiting apoptosis.

[Key words]liver;injury；carbon tetrachloride；p-nitro caffeic acid phenethyl ester；protective effects

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.008

基金项目：重庆市科委重点攻关项目(Cstc2011ggc10006-33)。

作者简介：游莉(1981-)，主管药师，硕士，主要从事临床药理学研究。△通讯作者，E-mail:zhidong073@hotmail.com。

[中图分类号]R961

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)06-0743-04

(收稿日期：2015-07-18修回日期：2015-09-25)