急性淋巴细胞白血病患儿外周血IL-17、IL-35及T淋巴细胞亚群的变化及意义

王西阁 张晓敏 赵雪莲 周玉洁 任瑞芳

急性淋巴细胞白血病患儿外周血IL-17、IL-35及T淋巴细胞亚群的变化及意义

王西阁 张晓敏 赵雪莲 周玉洁 任瑞芳

目的 本研究通过检测急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿外周血中IL-17、IL-35水平及T淋巴细胞亚群表达，探讨其在ALL发病中的作用。方法 选择141例ALL患儿，其中初诊76例(初诊组)、治疗后完全缓解65例(缓解组)，另选45例健康儿童为对照组。采用流式细胞术检测各组患儿

CD 3+T淋巴细胞、CD 4+T淋巴细胞、CD 8+T淋巴细胞的表达，酶联免疫吸附法检测IL-17、IL-35的水平。结果 IL-17的水平：初诊组(8.66±0.95)pg/ mL和缓解组(14.86±1.77)pg/mL均低于对照组(22.85±1.84)pg/mL(P<0.05)；IL-35的水平：初诊组(164.72±8.99)pg/mL和缓解组(125.63±8.41) pg/mL均高于对照组(69.07±3.23)pg/mL(P<0.05)；CD 3+T淋巴细胞、CD 4+T淋巴细胞的表达水平：初诊组［(60.75±3.16)%、（30.00±2.30）%］和缓解组［（67.31±2.94）%、（34.51±2.44）%］均低于对照组［（69.53±4.12）%、（38.18±2.39）%］(P<0.05)；CD 8+T淋巴细胞的表达水平：初诊租（33.32±3.01）%和缓解组（29.54±2.70）%高于对照组(25.87±2.01%)(P<0.05)；初诊组与缓解组之间的比较差异均有统计学意义(P<0.05)；CD 4+T淋巴细胞的表达水平与IL-17的水平呈正相关(r=0.678,P<0.01)，与IL-35的水平呈负相关(r=-0.688,P<0.01)。结论 ALL患儿存在不同程度的免疫异常，外周血中IL-17的低表达、IL-35的高表达，可能在ALL的发病中起重要作用。

急性淋巴细胞白血病；IL-17；IL-35；T淋巴细胞亚群；儿童

急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是指由未分化或分化程度较低的淋巴细胞在骨髓、淋巴结及脾脏等造血器官内无限增殖所致的血液系统恶性肿瘤[1]，为儿童最常见的恶性肿瘤。研究显示[2]，恶性肿瘤患者普遍存在免疫功能下降，主要体现在细胞免疫功能方面，且肿瘤的发生、发展与T淋巴细胞亚群有密切联系。调节性T细胞(Tregs)和辅助性T细胞17(Th 17)是新近发现的CD 4+T淋巴细胞亚群。Th 17细胞主要通过白介素17(interleukin-17，IL-17)来发挥作用。白介素35(interleukin-35，IL-35)主要由Tregs分泌，是其发挥免疫负调控的主要细胞因子之一。本文将初步探讨IL-17、IL-35 及T淋巴细胞亚群在ALL发病机制中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年1月～2015年4月在郑州大学第三附属医院及第一附属医院就诊的ALL患儿141例，其中初步确诊但未治疗的ALL患儿76例为初诊组，男46例，女30例，年龄1～14岁，中位年龄6岁；已经确诊并经系统化疗达到完全缓解的ALL患儿65例为缓解组，男39例，女26例，年龄2～13岁，中位年龄6岁。诊断标准及化疗方案均依据《小儿急性淋巴细胞白血病诊疗建议》[3]。另选同期本院儿童保健中心体检正常的儿童45例作为对照组，男27例，女18例，年龄3～15岁，中位年龄7岁。对照组患儿性别、年龄与初诊组、缓解组ALL患儿比较差异无统计学意义。本研究获得本院人体试验委员会批准及家属的知情同意。

完全缓解的标准为[4]：（1）临床无白血病细胞浸润所致的症状和体征，生活正常或接近正常。（2）血象：Hb≥90 g/L，中性粒细胞绝对值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L。外周血白细胞分类中无白血病细胞。（3）骨髓象：原始淋巴细胞＋幼稚淋巴细胞≤5%，红细胞及巨核细胞系正常。

1.2 研究方法

1.2.1 标本的采集 初诊组及缓解组患儿均于入院未治疗前抽取外周静脉血5mL，对照组为随机抽取外周静脉血5mL，其中3mL用EDTA管抗凝，6 h内流式细胞术分析，检测T淋巴细胞亚群；2 mL置于普通干燥管中，2500 r/min离心10 min，分离血清后，置于-80℃保存。

1.2.2 主要试剂及仪器 C D 4F I T C/C D 8P E/ CD 3PerCP试剂及红细胞裂解液均购自美国BD公司；IL-17、IL-35的ELISA试剂盒均购自美国R&D公司；酶标仪购自美国伯乐Bio-rad，洗板机购自美国热电thermo；FACSCalibur型流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2.3 流式细胞术检测CD 3+T淋巴细胞、CD 4+T淋巴细胞、CD 8+T淋巴细胞 先将流式管进行编号，然后将标本反复颠倒混匀；先取5μL CD 4FITC/CD 8PE/CD 3PerCP试剂加入到流式管底部，再取20 μL EDTA抗凝全血加入到流式管中，低速震荡混匀，室温避光15 min；加入200 μL 1×红细胞裂解液，室温避光10 min后上机，采用FACSComp软件分析检测。

1.2.4 细胞因子测定 外周血IL-17、IL-35水平的检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶标仪检测450 nm处吸光度值，以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，计算IL-17、IL-35水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理与分析。计量资料以“±s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，变量间的相关性分析采用Pearson积矩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血IL-17、IL-35的水平 初诊组和缓解组IL-17的水平均低于对照组(P<0.05)，且初诊组低于缓解组(P<0.05)；初诊组和缓解组IL-35的水平均高于对照组(P<0.05)，且初诊组高于缓解组(P<0.05)；各组间的比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组外周血IL-17、IL-35水平的比较(x±s,pg/mL)

2.2 T淋巴细胞亚群的水平 初诊组和缓解组CD 3+T淋巴细胞、CD 4+T淋巴细胞的表达水平均低于对照组(P<0.05)，CD 8+T淋巴细胞的表达水平高于对照组(P<0.05)，初诊组与缓解组之间的比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组外周血T淋巴细胞亚群测定结果的比较±s,%)

表2 各组外周血T淋巴细胞亚群测定结果的比较±s,%)

注:与对照组比较，aP<0.05；与缓解组比较，bP<0.05

组别例数CD 3+TCD 4+TCD 8+T对照组4569.53±4.1238.18±2.3925.87±2.01缓解组6567.31±2.94a34.51±2.44a29.54±2.70a初诊组7660.75±3.16ab30.00±2.30ab33.32±3.01abF值117.92175.85111.88 P值＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 相关性分析 ALL患儿外周血CD 4+T淋巴细胞的表达水平与IL-17的水平呈正相关(r＝0.678,P<0.01)，与IL-35的水平呈负相关(r＝-0.688,P<0.01)。

3 讨论

急性白血病(acute leukemia,AL)占所有儿童恶性肿瘤的25%～35%，根据骨髓细胞形态学分型分为急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)，儿童白血病以ALL为主，占60%～70%。其发病机制包括[5]：“二次打击”学说（如：染色体异位形成融合基因、多基因参与的第二次打击）、免疫因素、肿瘤干细胞等。近期的研究发现基因多态性也与白血病的易患性相关[6]，如叶酸代谢相关基因、细胞色素P 450和谷胱甘肽S-转移酶、苯醌氧化还原酶-1等。此外，研究发现[7]CASP 8AP 2基因启动子区-1189和-1176两个CpG位点的异常高甲基化可能与儿童ALL的发病相关。由于白血病的生物多样性，其病因及发病机制也是多因素的。本文主要从免疫因素方面探索儿童ALL的发病机制。

人体成熟T淋巴细胞亚群按功能不同可分为:辅助性T淋巴细胞(Th)、抑制性T淋巴细胞(Ts)和细胞毒性T淋巴细胞(Tc)；若按表型又可以分为CD 4+T淋巴细胞和CD 8+T淋巴细胞。CD 4+T淋巴细胞主要行使Th细胞的功能，而CD 8+T淋巴细胞主要行使Tc细胞的功能，因此根据CD 4+T淋巴细胞和CD 8+T淋巴细胞的数量，可初步评估机体免疫状态。研究表明，恶性血液病患者机体免疫功能失衡导致机体免疫力下降，抗肿瘤能力减弱，T淋巴细胞亚群的检测可以为恶性血液病的诊断、治疗及判断预后提供依据[8]。另有研究显示[9]细胞免疫与白血病的发生、发展及转归有关。本研究结果回示：ALL患儿初诊组及缓解组外周血CD 3+T淋巴细胞、CD 4+T淋巴细胞的表达水平均低于对照组(P<0.05)，而CD 8+T淋巴细胞的表达水平高于对照组(P<0.05)，初诊组与缓解组之间的比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示ALL患儿存在不同程度的免疫异常，与文献报告一致。

细胞因子介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要方式。大量研究表明细胞因子网络失衡是肿瘤细胞能够免疫逃逸的机制之一，与儿童白血病相关的细胞因子有干扰素调节因子-3(IRF-3)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、干扰素(IFN)和Toll样受体(TLR)等[6]。IL-17是一种具有多种生物学效应的细胞因子，主要由Th 17细胞产生，可以诱导产生多种细胞因子、趋化因子、炎症效应物质和抗微生物蛋白，从而参与多种自身免疫性疾病和感染炎症[10]。近年来，发现IL-17与肿瘤的关系密切。一方面IL-17可以通过诱导肿瘤的血管生成等来发挥促瘤效应；另一方面它又可以通过增强NK细胞、细胞毒性T细胞的活性来发挥抗肿瘤效应[11]。Th 17的表达根据不同的肿瘤类型而有差异。如在肺肿瘤中发现IL-17有效促进非小细胞肺癌细胞的生长和增殖，对肺癌调节性T细胞的免疫反应具有抑制作用[12]。在白血病患儿中的研究中发现[13]Th 17的表达低于对照组，且未缓解组更低。分析其原因可能为：(1)白血病细胞可能分泌一些抑制Th 17功能的因子，未缓解时体内肿瘤负荷高，抑制作用更强。(2)白血病患者由于经过化疗或放疗，机体免疫系统遭到破坏，因此，初始T细胞数量减少，其所分化的Th 17当然更少。(3)机体还存在一些抑制Th 17细胞的细胞亚群，如Th 1和调节性T细胞等，当白血病经过化疗达到缓解时，虽然Th 17的功能有所恢复，但这些抑制Th 17的细胞功能也有所恢复，综合作用的结果就是抵消了Th 17数量和功能的提高[14]。本研究结果回示：ALL患儿初诊组及缓解组外周血IL-17的水平均低于对照组(P<0.05)，提示IL-17可能参与了ALL患儿的发生发展。

IL-35属于IL-12家族，是一种由p 35和EBI 3亚基组成的异源二聚体分子,主要来源于Tregs并为其发挥最大免疫抑制功能所必需，从而在诱导和维持机体免疫耐受过程中发挥了重要作用[15-16]。目前研究认为IL-35可能广泛参与了体内的免疫应答过程，不仅在细胞内感染及炎症过程中起着重要的调节作用，而且与自身免疫病和肿瘤等多种临床疾病的发生、发展密切相关，成为细胞因子研究的新热点[17]。研究发现[18]，IL-35在AML患者体内高表达，分析原因可能为：IL-35通过抑制效应性T细胞(effector T cells,Teffs)和促进Tregs/iTr 35(IL-35诱导的调节性T细胞)的表达和功能以及直接促进AML细胞的增殖和抑制AML细胞的凋亡来诱导AML细胞的免疫逃逸，从而在介导AML的发生发展中具有重要作用。但在ALL中的发病机制目前不完全明确。本研究发现：ALL患儿初诊组及缓解组外周血IL-35的水平均高于对照组(P<0.05)，提示IL-35可能也参与了ALL患儿的发病过程。

综上所述，本研究表明，ALL患儿存在不同程度的免疫异常，外周血中IL-17的表达水平降低、IL-35的表达水平升高，且CD 4+T淋巴细胞的表达水平与IL-17的水平呈正相关，与IL-35的水平呈负相关，提示免疫异常、IL-17的低表达及IL-35的高表达可能参与了ALL的发生发展，但两两之间是否具有一定的因果关系，需要更加深入的研究。

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Objective The study was to detect the levels of IL-17 and IL-35 and the expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood, to explore its role in the pathogenesis of acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods One hundred and forty-one cases with ALL were divided into two groups: Group A (n=76) who were confirmedly diagnosed but not yet treated; Group B (n=65) who were confirmedly diagnosed and treated systematically with chemotherapy; and 45 healthy children were selected as the control group. Flow cytometry (FCM) was used to measure the expression of T lymphocyte subsets, and the levels of IL-17 and IL-35 were determined with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Results The level of IL-17 in Group A and Group B was significantly lower than that in control group (P<0.05). On the contrary, the level of IL-35 in Group A and Group B was significantly higher than that in control group (P<0.05). The expressions of CD 3+T and CD 4+T cells in Group A and Group B were significantly lower than those in control group (P<0.05),and the CD 8+T cells level increased significantly (P<0.05), significant difference was found between Group A and Group B (P<0.05). The expression of CD 4+T cells was positively correlated with the level of IL-17 (r=0.678,P<0.01), but negatively correlated with the level of IL-35 (r=-0.688,P<0.01). Conclusion There are immune disorders of varying degrees in ALL children, and the expression of IL-17 and IL-35 in peripheral blood may paly an important role in the pathogenesis of ALL.

Acute lymphocytic leukemia; Interleukin-17; Interleukin-35; T lymphocyte subsets; Child

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.2.003

河南 450052 郑州大学第三附属医院小儿血液/肿瘤科 （王西阁 张晓敏 赵雪莲 周玉洁 任瑞芳）