4个白杨新品种和父母本及近缘种的SRAP遗传分析与指纹图谱构建

樊　蓉，樊军锋,李周岐

(西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)



4个白杨新品种和父母本及近缘种的SRAP遗传分析与指纹图谱构建

樊蓉，樊军锋,李周岐

(西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

[摘要]【目的】 对外观相近、较难区分的4个白杨新品种及其父母本和3个近缘种进行遗传分析并构建指纹图谱，为这些品种在生产应用中的分子鉴定提供技术依据。【方法】 采用SRAP分子标记技术，对03-4-9、03-4-22、03-5-17和03-6-11 4个白杨新品种及I-101杨、截叶毛白杨、84K、毛白杨30号、银毛杨共9个白杨品种开展遗传分析及指纹图谱构建。【结果】 14对多态性高的SRAP引物对9个白杨品种共扩增出167条条带，平均每对引物扩增条带为11.93 条。其中多态性条带143条，多态性比率为85.63%，多态性高。聚类分析表明，9个白杨品种之间的遗传相似系数为0.40～0.76,其中4个白杨新品种与父本截叶毛白杨和毛白杨30号亲缘关系较近，遗传相似系数平均值分别为0.65和0.63 ，与母本I-101亲缘关系稍远，遗传相似系数平均值为0.49。利用重复性好的3对引物(me5/em10、me7/em2 和me7/em3)扩增图谱构建了9个白杨品种的指纹图谱，每对引物均可将9个白杨品种单独区分开。【结论】 9个白杨品种在SRAP位点有较高的多态性，SRAP分子标记能很好地用于杨树品种的鉴定及指纹图谱构建。

[关键词]杨树；杂种；SRAP；分子标记；指纹图谱

杨树(Populus)生长快、抗逆性(抗旱、抗寒、抗病虫等)强，适应范围广，是我国用材林、防护林及园林绿化的主要造林树种，经济、生态、园林价值大[1-3]。

杨树品种多起源于杂交育种，由于长期杂交，各品种之间遗传关系复杂，不少品种之间亲缘关系较近，形态特征差异很小，仅通过外观形态特征很难区分，严重影响其品种鉴定、知识产权保护及良种推广，因此利用分子标记技术准确鉴定杨树品种具有重要意义[4-6]。

序列扩增多态性 (Sequence related amplified polymphism，SRAP)是一种基于PCR的新型分子标记，是由美国加州大学蔬菜学作物系的Li和Quiros[7]于2001年提出的一种使用双引物的分子标记技术，与其他分子标记技术相比，其突破点在于设计特殊引物对基因的阅读框区域(ORFs)进行扩增，多态性由各物种间差异大的内含子、启动子和间隔序列产生[8-10]，提高了扩增结果和表型相关性，且并不需要预知被测物种的序列信息，大大降低了引物开发成本。 SRAP现已在农业作物遗传多样性分析、基因定位、比较基因组学以及杂种优势预测等方面有不少应用[11-13]，但在林木中应用较少[6，14]。

03-4-9、03-4-22、03-5-17、03-6-11系西北农林科技大学新选育出来的4个白杨新品种，其母本I-101杨，是从意大利引进的银白杨，父本截叶毛白杨，为毛白杨变种[1]。这6个品种与84K、毛白杨30号和银毛杨3个近缘品种的外观形态特征，特别是苗期形态特征非常接近，较难区别，在生产中易造成混乱。本试验利用SRAP分子标记对4个杨树新品种、其父母本及3个近缘种开展遗传分析，构建品种指纹图谱，以期为杨树新品种的分子鉴定、生产推广提供技术依据。

1材料与方法

1.1试验材料

2014年5月在西北农林科技大学渭河试验站采集9个供试白杨品种(表1)苗木的幼嫩叶片，锡纸包裹，分别编号后，置于液氮罐中带回。

表 1　供试白杨品种及其遗传背景

1.2DNA提取

用TIANGEN植物基因组提取试剂盒提取杨树叶片基因组DNA，8 g/L琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观测电泳条带(制胶时加入1～2 μL EB衍生物Golden view，以便在紫外灯下快速准确地观察条带)。最后，比照亮度和DNA质量浓度对照表，将DNA质量浓度调至30 ng/μL，-20 ℃保存备用[15]。

1.3SRAP反应

1.3.1引物的筛选与合成引物序列选用Li等[7]于2001年发表的引物序列，其中9条正向引物和10条反向引物的序列信息见表2。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.2PCR扩增体系及程序参照陈罡等[9]优化后的杨树SRAP反应体系，PCR的扩增反应体系为：总体积20 μL，其中2×TapMasterMix(康为世纪)10 μL，10 μmol/L正向、反向引物各1 μL，模板1 μL(50 ng)，RNase-Free Water 7 μL。

PCR扩增采用复性变温法，程序如下(两步反应)：(1)94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，37 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，5个循环；(2)94 ℃变性1 min，54 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。

1.3.3PCR扩增产物的检测用 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带(1×TBE),上样5 μL，稳压260 V。电泳130 min后，用谭碧玥等[10]的改良银染法染色，并拍照分析。

表 2　鉴别白杨及其近缘种的SRAP引物

1.4数据处理与分析

采用分子标记条带统计分析常用的NTSYSpc version2.10聚类分析软件处理数据。首先人工统计胶上条带的有无和迁移距离，建立(0，1)数据阵(将胶上同一迁移位置处有带记为1，无带记为0)。然后将数据阵建立Excel数据表格，导入该软件，利用公式GS=m/(m+n)和GD=1-GS(m为基因型间共有带数目，n为差异带数目)计算遗传相似系数(GS)和遗传距离(GD)，最后采用UPGMA数据聚类算法进行品种聚类分析，构建树状聚类图。

2结果与分析

2.1SRAP引物对9个白杨品种的扩增结果及多态性分析

9个正向引物和10个反向引物共可组成90对引物组合，经预试验，最终从90对引物中筛选出14对多态性高的引物对9个试供白杨品种进行正式扩增，扩增结果见表3。

表 3　14对SRAP引物对9个白杨品种的扩增结果

从表3可知,14对引物共扩增出167条条带(只计清晰条带)，平均每对引物11.93 条，多态性条带143条，多态性比率为85.63%，多态性高；14对引物中，me5/em7扩增的条带数最多，为26条，me8/em4扩增的条带数最少，仅有2条。me5/em10、 me7/em2 和me7/em3 3对引物扩增结果见图1。

图 1　me5/em10、me7/em2 和me7/em3 3对引物对9个白杨品种的扩增图谱

2.29个白杨品种间的遗传相似系数及聚类分析

统计各引物在9个白杨品种上的SRAP扩增条带，建立(0,1)矩阵，利用NTSYSpc version2.10聚类分析软件计算各品种间的遗传相似系数，结果见表4。 从表4可知，9个白杨品种间的遗传相似系数变化于0.40～0.76。03-6-11与03-5-17，03-4-9与03-5-17来自相同的杂交组合，遗传背景相同，遗传相似系数最大，均为0.76；03-6-11和84K遗传相似程度相对最小，遗传相似系数为0.40。其余各品种遗传相似系数介于以上两类之间。

表 4　9个白杨品种间的遗传相似系数

用9个白杨品种间的遗传相似系数，绘制出9个品种的树状聚类图，结果见图2。

图 2　9个白杨品种的聚类分析结果

由图2可知，9个白杨品种在遗传相似系数0.49 水平以下分为2个类群。在类群Ⅰ中，03-5-17、03-4-9、03-6-11、截叶毛白杨、03-4-22在遗传相似系数为0.65水平上先聚在一起，再在遗传相似系数为0.63时与毛白杨30号聚为一类，说明4个白杨杂交新品种之间及其与父本截叶毛白杨和毛白杨30号之间的遗传相似程度最高。在类群Ⅱ中，4个白杨新品种的母本I-101与84K先在遗传相似系数为0.64时聚为一类，然后在遗传相似系数为0.58时与银毛杨聚为一类，说明此3个品种间有较高的遗传相似度，且与银毛杨相比，I-101与84K遗传相似程度较高。所有9个白杨品种最终在遗传相似系数大约为0.49水平上聚为一类，说明这9个品种之间总体上仍有较高的遗传相似性。

2.39个白杨品种的分子指纹图谱

参照14对SRAP引物的扩增结果，最终选取me5/em10、me7/em2 和me7/em3 3对扩增条带清晰、重复性好的引物扩增结果，构建9个白杨品种的指纹图谱(表5)，发现每个引物均可将9个品种单独区分开。

表 5　基于me5/em10、me7/em2 和me7/em3引物对扩增结果构建的9个白杨品种的指纹图谱

注：1.03-5-17；2.I-101；3.毛白杨30号；4.84K；5.03-4-22；6.03-4-9；7.银毛杨；8.03-6-11；9.截叶毛白杨。

Note：1.03-5-17；2.I-101；3.P.tomentosaNo.30；4.84K；5.03-4-22；6.03-4-9；7.P.alba(China)×P.tomentosa；8.03-6-11；9.P.tomentosavar.truncata.

3结论与讨论

用从90对SRAP引物组合中选出的14对多态性引物，对9个白杨品种的DNA进行PCR扩增，共扩增出167条清晰条带，平均每对引物扩增条带为 11.93 条，其中多态性条带143条，多态性比率为85.63%，多态性高。

各杨树品种之间的遗传相似系数为0.40～0.76，即品种间遗传相似程度变幅较大，各品种之间亲缘关系远近有一定差异，但4个新品种之间遗传相似系数较大(0.67～0.76)，亲缘关系较近。

选取扩增效果较好、条带清晰、重复性较高的3对引物的扩增图谱，构建了4个白杨新品种、父母本及3个近缘种的分子指纹图谱，为新品种的分子鉴定、知识产权保护、生产推广提供了技术依据。

聚类分析中，4个白杨新品种在遗传相似系数较高水平上与父本截叶毛白杨[2]较早聚为一类(类群Ⅰ)，而后与母本I-101在遗传相似系数较低水平上聚为同类，可能是由于这4个新品种在人工选育时更多地选择了父本的优良性状而较少选择母本性状造成。经大田观察，这4个新品种在叶、芽、物候等多个性状上与父本截叶毛白杨非常接近，这一事实也很好地解释了上述推测。

母本I-101(银白杨)与84K(银白杨×腺毛杨)首先聚为一类，随后与银毛杨(银白杨(中国)×毛白杨)聚为同类(类群Ⅱ)，主要是由于这3个品种均含有银白杨遗传成分。

银毛杨为银白杨(中国)×毛白杨杂交组合中选育出的一个白杨杂种[1]，与4个白杨新品种(均来源于银白杨(意大利)×毛白杨杂交组合，但杂交所用银白杨产地为意大利，毛白杨为截叶毛白杨)遗传背景最为接近，理论而言应与4个新品种最先聚在一起。但本试验中银毛杨在较低相似系数(0.49)水平上才与4个新品种聚成同类，与理论推测有一定差距。其原因可能是由于母本意大利银白杨与中国银白杨、父本毛白杨与截叶毛白杨(毛白杨系杂种起源，种内不同类型及单株之间遗传变异很大)之间基因差异较大造成的。

SRAP是一种相对理想的构建指纹图谱的新型分子标记，在农作物中已有较多应用[11-13]。本试验首次采用SRAP分子标记技术对4个白杨新品种与其父母本及3个近缘种进行了SRAP遗传分析与指纹图谱构建，结果证明SRAP同样适用于杨树的遗传分析与指纹图谱构建，扩增条带清晰、多态性高，效果好。

[参考文献]

[1]牛春山.陕西杨树 [M].西安：陕西科学技术出版社，1980.

Niu C S.Shaanxi,Populus[M].Xi’an:Shaanxi Science & Technology Press,1980.(in Chinese)

[2]徐纬英.杨树 [M].哈尔滨：黑龙江人民出版社，1988.

Xu W Y.Populus[M].Harbin:Heilongjiang People’s Publishing House,1988.(in Chinese)

[3]樊军锋,周永学,高建社,等. 陕西杨树育种历史及展望 [J].西北林学院学报,2004,19(2):77-81.

Fan J F,Zhou Y X,Gao J S,et al.Historical review ofPopulusbreeding achievements of Shaanxi province and it’s future breeding strategy [J].Journal of Northwest Forestry University,2004,19(2):77-81.(in Chinese)

[4]郭娟,樊军锋,梁军,等.利用SRAP标记鉴别美洲黑杨及指纹图谱构建 [J].西北林学院学报,2014,29(2):98-102.

Guo J,Fan J F,Liang J,et al.Identification and fingerprinting ofPopulusdeltoidesusing SRAP markers [J].Journal of Northwest Forestry University,2014,29(2):98-102.(in Chinese)

[5]刘春英,樊军锋,高建社,等.杨树新杂种的SSR分析及鉴定 [J].西北林学院学报,2013,28(2):70-73.

Liu C Y,Fan J F,Gao J S,et al.SSR analysis and identify of newPopulushybrid [J].Journal of Northwest Forestry University,2013,28(2):70-73.(in Chinese)

[6]陈罡,邢兆凯,潘文利,等.辽宁地区主栽杨树品种的SRAP标记遗传多样性分析 [J].东北林业大学学报,2010(10):19-22.

Chen G,Xing Z K,Pan W L,et al.Genetic diversities ofPopulusin Liaoning area by using SRAP markers [J].Journal of Northeast Agriculture University,2010(10):19-22.(in Chinese)

[7]Li G,Quiros C F.Sequence related amplified polymorphism(SRAP),A new marker system based on a simple PCR reaction its application to mapping and gene tagging inBrassica[J].Theor Appl Genet,2001,103:455-461.

[8]李巧燕,林瑞庆,朱兴全.SRAP分子标记及其应用概述 [J].热带医学杂志，2006(4):468-469.

Li Q Y,Lin R Q,Zhu X Q.SRAP molecular marker and its application [J].Journal of Tropical Medicine,2006(4):468-469.(in Chinese)

[9]陈罡,关明东,叶景丰,等.杨树SRAP-PCR 反应体系的建立与优化 [J].北方园艺,2010(16):132-134.

Chen G,Guan M D,Ye J F,et al.Establishment and optimization of SRAP-PCR reaction system inPopulus[J].Northern Horticulture,2010(16):132-134.(in Chinese)

[10]谭碧玥,王源秀,徐立安.杨树基因组SRAP扩增体系的建立与优化 [J].林业科技开发,2009(2):25-29.

Tan B Y,Wang Y X,Xu L A.Establishment and optimization of SRAP-PCR reaction system ofPopulus[J].China Forestry Science and Technology,2009(2):25-29.(in Chinese)

[11]邱文武,孙伟生,窦美安.基于PCR的新型分子标记SRAP研究进展 [J].江西农业学报,2007,19(8):26-28.

Qiu W W,Sun W S,Dou M A.Studying progress in SRAP new molecular markers based on PCR reaction [J].Acta Agriculturae Jiangxi,2007,19(8):26-28.(in Chinese)

[12]张安世,邢智峰,刘永英,等.SRAP 分子标记及其应用 [J].安徽农业科学,2007,35(9):2562-2563.

Zhang A S,Xing Z F,Liu Y Y,et al.SRAP molecular marker and its application [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2007,35(9):2562-2563.(in Chinese)

[13]关强,张月学,徐香玲,等.DNA 分子标记的研究进展及几种新型分子标记技术 [J].黑龙江农业科学,2008(1):102-104.

Guan Q,Zhang Y X,Xu X L,et al.Development of DNA molecular marker and several new types of molecular markers [J].Heilongjiang Agricultural Sciences,2008(1):102-104.(in Chinese)

[14]刘艳萍,郭志富,刘玉东,等.应用SRAP标记分析新疆地区主要杨属树种的遗传多样性 [J].植物生理学通讯,2008(2):225-228.

Liu Y P,Guo Z F,Liu Y D,et al.Genetic diversities ofPopulusin Xinjiang based on SRAPs markers [J].Plant Physiology Communications,2008(2):225-228.(in Chinese)

[15]马明，杨克强，郭起荣.改良CTAB法提取林木树种基因组DNA的研究 [J].生物技术,2007,17(3):36-38.

Ma M,Yang K Q,Guo Q R.Studies on genomic DNA extraction of forest species with improved CTAB method [J].Biotechnology,2007,17(3):36-38.(in Chinese)

SRAP markers based identification and fingerprinting of 4 new hybrids,male and female parents and 3 related varities ofPopulusL.Sect.LeuceDuby

FAN Rong,FAN Jun-feng,LI Zhou-qi

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 Genetic relationship and DNA-fingerprinting of 9 Populus L.in Sect.Leuce Duby verities (4 new hybrids,male and female parents,and 3 related verities) that were difficult to be distinguished by appearance were investigated using molecular markers technique to improve molecular identification during production.【Method】 SRAP molecular markers were used to conduct genetic analysis and build fingerprints for 03-4-9,03-4-22,03-5-17,03-6-11,P.alba (Italy),P.tomentosa var.truncata,P.alba×P.glandoulsa,P.tomentosa No.30,and P.alba(China)×P.tomentosa.【Result】 A total of 167 bands were amplified with 14 pairs of primers,with the mean of 11.93 per primer.There were 143 polymorphic bands with a ratio of 85.63%.Cluster analysis showed that the genetic similarity coefficients among the 9 varieties were 0.40-0.76,and 4 new hybrids had close genetic relationship with P.tomentosa var.truncata(male parent) and P.tomentosa No.30 with the mean coefficients of 0.65 and 0.63,respectively.The genetic relationship between 4 new hybrids and P.alba (Italy,female parent) was less close with the mean coefficient of 0.49.The fingerprints of 9 varieties were established by amplification map of 3 repeatable primers (me5/em10,me7/em2,and me7/em3),and the 9 varieties could be identified separately. 【Conclusion】 The 9 poplar varieties had high polymorphism in SRAP sites,and SRAP molecular markers technique could be used for identification and fingerprint establishment of Poplar varieties.

Key words:Populus L.;hybrids;SRAP;molecular markers;fingerprinting

DOI：网络出版时间:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.011

[收稿日期]2014-07-10

[基金项目]国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BAD01B0302)

[作者简介]樊蓉(1988-)，女，陕西杨凌人，硕士，主要从事林木遗传育种、林业生物技术研究。E-mail:64112914@qq.com[通信作者]樊军锋(1962-)，男，陕西扶风人，博士，教授，主要从事林木遗传育种研究。E-mail:fanjf28@163.com

[中图分类号]S792.11

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)04-0081-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.022.html