类风湿关节炎患者嗜碱性粒细胞与疾病活动度和Th1应答失衡的关系①

唐　培　陈秋华　路　杰　兰巧芬　廖焕金　陈燕文　李尚妹　吴　平　刘华锋　谢　彤　潘庆军

(广东医学院附属医院临床医学研究中心&风湿免疫科，湛江524001)



类风湿关节炎患者嗜碱性粒细胞与疾病活动度和Th1应答失衡的关系①

唐培②陈秋华路杰兰巧芬廖焕金陈燕文李尚妹吴平刘华锋谢彤潘庆军

(广东医学院附属医院临床医学研究中心&风湿免疫科，湛江524001)

[摘要]目的：探讨RA患者外周嗜碱性粒细胞的活化情况和活化机制，以及与疾病活动度和Th1/Th2应答失衡的关系。方法：本研究运用流式细胞术检测类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中Th1/Th2细胞的比值和嗜碱性粒细胞数量及活化水平，用ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-4水平，用Western blot法检测血清中循环的IgE型免疫复合物(IgE-CIC)的水平。结果：Th1/Th2细胞比值与DAS28评分呈低度线性正相关关系；RA患者血清IFN-γ水平较对照组显著升高，且和疾病活动度相关，但IL-4的水平则无差异；RA患者嗜碱性粒细胞数量较对照组显著降低，且高度活化(高表达CD203c和CD62L)；RA患者外周血存在高水平的IgE-CIC,而对照组则无。结论：RA患者外周血嗜碱性粒细胞高度活化、数量显著减少，可能会迁徙至次级淋巴组织和炎症部位，对抗外周Th1应答失衡，有望为RA的防治提供新的线索。

[关键词]类风湿关节炎; 嗜碱性粒细胞; Th1 细胞; IFN-γ; IL-4

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种常见的T、B细胞免疫应答失衡并以炎症细胞浸润关节滑膜为特征的慢性自身免疫性疾病，常伴有血清类风湿因子阳性等特点。其发病机制虽尚未完全解析，但是Th1/Th2应答失衡在RA疾病的发展中起到重要作用[1]。既往关于RA患者Th1/Th2应答失衡的研究，主要认为活动期RA患者外周血中以Th1介导的细胞应答为主[1]。近来研究发现，在RA发病早期外周血中以Th2应答为主，而长期慢性RA则是以Th1应答为主[2]。在RA出现临床关节病变的最早期，滑膜和滑膜液中出现短暂的Th2型细胞因子谱(IL-4和IL-13)但显著缺乏Th1型细胞因子谱(IFN-γ)，这可决定早期滑膜炎发展成RA，而不是非RA持久性滑膜炎[3]。Aarvak[4]首次发现1例成年活动期RA患者滑膜中以Th2应答为主而外周血PBMC以Th1应答为主，两年后发展为滑膜中以Th0和Th1应答为主，且与RA炎症相关。以上研究说明Th1/Th2型细胞因子的产生在RA疾病的早期和晚期不同，提示在疾病的不同阶段可能存在Thl/Th2应答模式的改变，而且在不同部位如外周循环系统和关节局部所起的作用可能不同，仍需进一步深入探讨。

近年来，随着嗜碱性粒细胞(Basophil)条件缺失技术的发展和高纯度细胞分选技术的应用，发现它是Th2细胞早期分化过程中主要细胞因子IL-4的产生细胞，可调节Th2型免疫应答，进而参与Th2免疫介导的相关疾病。此外，还发现嗜碱性粒细胞可表达MHCⅡ类分子和共刺激分子，并可迁移至引流淋巴结，摄取抗原并提呈给初始T淋巴细胞，参与抗原递呈[5]。但嗜碱性粒细胞在RA发病中的作用和机制尚未见报道。

本研究拟对RA患者体内Th1和Th2水平及嗜碱性粒细胞的数量和活化状态进行检测，并进一步探讨嗜碱性粒细胞的活化机制，有望为嗜碱性粒细胞靶向防治RA提供线索。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象2013年10月至2014年9月在广东医学院附属医院风湿免疫科确诊的RA患者62例，平均年龄为(49.5±1.5)岁，病程(7.6±4.9)年，所有入选病例均符合1987年美国风湿病学会RA分类标准[6]。活动期RA患者62例(根据疾病活动度指标DAS28评分(评分≤5.1为低中活动度组，评分>5.1为高活动度组)，其中低中活动度RA患者33例，高活动度RA患者29例，另有22例本院同期健康志愿者(男4例，女18例)作为对照组，对照组平均年龄(46.7±2.5)岁。

1.1.2检测试剂荧光抗体PE-anti-human CD203c，APC/Cy7-anti-human CD62L，Percp-anti-human CD3，FITC-anti-human CD8，Alexa Fluor 647-anti-human IFN-γ， PE/Cy7--anti-human IL-4，均购自Biolegend公司。抗人IgE抗体(HRP)，购自Abcam公司。人IL-4 ELISA试剂盒和人IFN-γ ELISA 试剂盒购自博士德生物技术公司。红细胞裂解液和固定液购自eBioscience公司。人外周血淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物科技公司。刺激剂 PMA-lonomycin和阻断剂BFA-monomycin购自杭州联科生物技术公司。所有试剂均严格按照厂家说明书保存和操作。

1.2实验方法

1.2.1流式检测外周血中Th1/Th2细胞的比值和嗜碱性粒细胞数量和活化指标采集RA病人和正常对照组EDTA抗凝的外周静脉血，密度梯度离心法获得PBMC。各组加入刺激剂PMA-lonomycin于37℃孵育4 h后，再加入阻断剂BFA-monensin混匀，37℃孵育2 h。PBS洗涤后用染色液重悬，加入抗CD3和CD8抗体混匀，37℃孵育30 min。PBS洗涤后加入固定液混匀，37℃孵育15 min，再加入通透液混匀，1 500 r/min×6 min离心洗涤一次。弃上清，加入通透液和抗IL-4和IFN-γ抗体混匀，37℃孵育30 min。PBS洗涤重悬后用流式细胞仪进行检测。以CD3+CD8-标记为CD3+CD4+T细胞。以IFN-γ和IL-4同型对照为标准设门确定Th1和Th2细胞亚群位置。采集RA病人和正常对照组EDTA抗凝的外周静脉血，取200 μl加入CD203c及CD62L抗体混匀，37℃孵育30 min。再加入红细胞裂解液混匀，避光放置15 min。1 500 r/min×6 min离心后PBS 洗涤一次并重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。以CD203c和CD62L抗体的同型对照为标准设门识别嗜碱性粒细胞。结果以嗜碱性粒细胞表达CD203c和CD62L平均荧光强度(Median fluorescence intensity,MFI)的相对值表达。

1.2.2ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-4水平采集RA病人和正常对照组外周静脉血4 ml，静置后1 500 r/min×15 min离心后收集血清，-80℃冻存备检。按照说明书操作，最后用酶标仪在450nm测定吸光度(OD)值。应用Excel程序建立标准曲线计算血清IFN-γ及IL-4浓度。

1.2.3免疫印迹法检测外周血中IgE型免疫复合物(IgE-CIC)水平采集RA病人和正常对照组外周静脉血4 ml，静置后1 500 r/min×15 min离心后收集血清，常规双聚乙二醇(PEG 6000)法提取循环免疫复合物[7]。然后经SDS-PAGE 电泳和转膜后进行免疫印迹染色，即5%封闭蛋白封闭2 h后加入抗人IgE-HRP(1∶800)4℃过夜。PBS洗涤后曝光。

2结果

2.1RA患者外周Th1/Th2细胞的比值及其与DAS28评分的相关性结果显示，Th1/Th2细胞比值与DAS28呈线性正相关关系 (图1A)。RA患者高活动度组Th1/Th2细胞比值显著高于低中活动度组和对照组(图1B)。

2.2RA患者血清IFN-γ和IL-4水平RA患者高活动度组血清IFN-γ水平显著高于低中活动度组和对照组(图2A)，而三组血清IL-4的水平则无显著性差异(图2B)。

2.4对照组与RA患者外周嗜碱性粒细胞数量和活化度的比较以CD203c阳性识别外周嗜碱性粒细胞(图3A、B)[8]，在流式细胞术检测图上，嗜碱性粒细胞主要分布于淋巴细胞的右上部分。通过检测其CD203c和CD62L的表达水平，可分析其活化程度(图3C、D)。

图1　RA患者外周血Th1/Th2细胞的比值及其与DAS28评分的相关性Fig.1　Ratio of Th1/ Th2 cells in RA patients and its correlation with DAS28 scoreNote: The control group (n=22),low and medium activity RA group (n=33) and high activity RA group (n=29).*.P<0.05.

图2　RA患者血清IFN-γ和IL-4水平的比较Fig.2　Serum levels of IFN-γ and IL-4Note: The control group (n=22),low and medium activity RA group (n=33) and high activity RA group (n=29).*.P<0.05，***.P<0.001.

RA患者高活动度组和低中活动度组CD203c阳性嗜碱性粒细胞数量均低于对照组，差异有统计学意义；高活动度组与低中活动度组CD203c阳性嗜碱性粒细胞数量比较，差异无统计学意义(图4A)。RA患者高活动度组和低中活动度组嗜碱性粒细胞CD203c MFI均高于对照组，差异有统计学意义；高活动度组与低中活动度组嗜碱性粒细胞MFI比较，差异无统计学意义 (图4B)。RA患者高活动度组嗜碱性粒细胞CD62L的MFI高于低中活动度组和对照组，而低中活动度组又高于对照组，差异有统计学意义 (图4C)。

图3　流式细胞术中外周血嗜碱性粒细胞的识别和活化指标的量化Fig.3　Detection of basophils and its activation markers in flow cytometryNote: A.Scattergram of peripheral blood;B.The abszisse abscissa is PE-CD203c,P1 gate representatives basophils population;C.The abszisse abscissa representatives fluorescence intensity of PE-CD203c;D.The abszisse abscissa representatives fluorescence intensity of APC-Cy7-CD62L.

图4　对照组与RA患者外周嗜碱性粒细胞数量和活化度的比较Fig.4　Comparison of control group and RA patients with peripheral basophils quantities and activation degreesNote: The control group (n=22),low and medium activity RA group (n=33) and high activity RA group (n=29).**.P<0.01,***.P<0.001.

图5　对照组和RA患者外周血循环IgE型免疫复合物水平Fig.5　Levels of IgE-CIC in serum of control and RA patientsNote: A.WB of IgE-CIC in the serum of control group and RA patients；B.Analysis of the WB results of IgE-CIC in the serum of control group (n=22),RA patients with low and medium activity group (n=33) and the high activity group (n=29)；***.P<0.001.

2.5RA患者血循环IgE型免疫复合物水平免疫印迹发现RA患者外周血循环内存在高水平IgE型免疫复合物(IgE-CIC)，高活动度组高于低中活动度组和对照组(图5A、B)。

3讨论

首先，本研究应用流式细胞术检测Th1/Th2细胞的比例和ELISA法检测血清IFN-γ和IL-4水平，结果均发现，RA患者外周以Th1应答为主。基于本组入选病人病程(7.6±4.9年)较长，且主要为中老年患者(49.5±1.5岁)，故推测其发病状态主要处于发病的中晚期，符合文献报道的长期慢性RA则是以Th1应答为主[2]。

嗜碱性粒细胞的活化后可释放大量的活性介质(组胺、白三烯、细胞因子等)[9]，进而介导组织损伤[10]，同时表面标志物CD203c、CD63和CD11b等表达上调[10,11]。本研究以CD203c和CD62L为活化标记探讨RA患者嗜碱性粒细胞活化情况[8]。结果发现活动期RA患者外周嗜碱性粒细胞数量显著降低，活化程度显著升高。将RA患者根据DAS28评分划分为低活动度、中活动度和高活动度组，由于低活动度组例数较少，因此我们将低活动度与中活动度组合并与高活动度组进行比较后发现RA患者活动度越高，外周血中嗜碱性粒细胞的活化程度越高，即嗜碱性粒细胞的活化水平与疾病活动度相关。提示，嗜碱性粒细胞数量和活化程度有望作为评估RA疾病活动度的新指标。已报道，嗜碱性粒细胞位于外周血循环中，较少迁移至其他组织器官但其表达黏附分子CD62L(一种淋巴归巢受体)[12,13]，可介导淋巴细胞通过高静脉内皮细胞向次级淋巴组织器官迁移[14]。同时有文献报道，在以Th2应答为主的Lyn-/-狼疮样小鼠外周血嗜碱性粒细胞CD62L表达上调，同时在其脾脏和淋巴结均可见嗜碱性粒细胞的浸润[12]，提示CD62L可能介导外周血嗜碱性粒细胞向次级淋巴组织器官迁移。本研究结果提示，在RA患者中，CD62L可能介导活化的嗜碱性粒细胞向次级淋巴组织器官或者关节滑膜等炎症部位迁移导致外周血嗜碱性粒细胞数量减少，仍需要检测RA患者次级淋巴组织和炎症部位，如关节滑膜中嗜碱性粒细胞的浸润情况。

嗜碱性粒细胞可通过IgE依赖或非IgE依赖途径活化[5]，但在RA发病中活化机制尚未见报道。本研究用PEG沉淀试验[7]发现RA患者血清中含高水平的IgE型免疫复合物。也有同行报道，IgE型免疫复合物在RA患者体内存在，特别是合并有重度关节炎和血管炎的患者体内更为普遍[15-17]。IgE型抗核抗体在RA病人血清中以免疫复合物的形式存在[18]，并且这些免疫复合物可以激活嗜碱性粒细胞[13]。在RA患者外周血和关节液中可检测到包含IgE抗体的IgE-CIC[19-21]，且IgE-CIC阳性的RA患者疾病活动度高于阴性的RA患者[21]。此外，IgE-CIC还可活化多种炎症效应细胞，如肥大细胞、中性粒细胞和单核细胞等[19,23]，促进RA疾病的进展。另有报道，瓜氨酸化蛋白和IgE型抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)形成的免疫复合物可通过与FcεRI受体交联活化RA患者的嗜碱性粒细胞[24]。

综上所述，RA患者外周血嗜碱性粒细胞高度活化、数量显著减少，可能会迁徙至次级淋巴组织和炎症部位，对抗外周Th1应答失衡，有望为RA的防治提供新的线索。

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[收稿2015-08-25修回2015-09-15]

(编辑倪鹏)

Relationships between basophil and disease activity and imbalance of Th1 responses in rheumatoid arthritis patients

TANGPei,CHENQiu-Hua,LUJie，LANQiao-Fen,LIAOHuan-Jin,CHENYan-Wen,LIShang-Mei,WUPing,LIUHua-Feng,XIETong,PANQing-Jun.

ClinicalResearchCenter&DepartmentofRheumatologyandImmunology，AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001，China

[Abstract]Objective:To investigate the activation state of peripheral basophil from RA patients and its mechanism,and the relationship between disease activity and imbalance of Th1/Th2 response.Methods: Flow cytometry was employed to test the ratio of Th1/Th2 cell and the number of basophil and its activation state in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from rheumatoid arthritis (RA).ELISA was used to measure serum levels of IFN-γ and IL-4.Western blot was employed to detect serum circulating immune complexes containing IgE (IgE-CIC).Results: The ratio of Th1 to Th2 cell have a low linear correlation with the DAS28 score.Serum levels of IFN-γ in patients with RA was significantly higher than the control group,and correlated with the disease activity,but not IL-4.Levels of basophil of RA patients was significantly reduced compared with the control group,and highly activated (high expression of CD203c and CD62L).The presence of high levels of IgE-CIC in RA patients,but not in control group.Conclusion: Peripheral basophil of RA patients that were highly activated and significantly reduced,may migrate to secondary lymphoid tissues and sites of inflammation to against the imbalance of Th1 response,which may provide new clues for the prevention and treatment of RA .

[Key words]Rheumatoid arthritis;Basophil;Th1 cells;IFN-γ;IL-4

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.022

作者简介：唐培(1989年-)，女，硕士，主要从事自身免疫性疾病发病机制的研究。通讯作者及指导教师：谢彤(1967年-),男，硕士，主任医师，主要从事风湿免疫性疾病防治研究，E-mail:xt1234@163.com。潘庆军(1978年-),男，博士，副教授，主要从事风湿免疫性疾病发病机制研究，E-mail:stilwapan@gmail.com。

中图分类号R593.22

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0702-05

①本文受国家自然科学基金(81471530)和广东省自然科学基金(S2013010011568)资助。

②同时供职于武汉大学人民医院检验科，武汉430060。