HPLC法同时测定辣椒面中碱性橙2，21，22和酸性橙II的含量

杨园园，许乾丽，黎殊

贵州省食品检验检测所，贵阳 550001)

辣椒面作为贵州具有特色的辣椒制品，深受消费者喜爱。近年来，因违法添加染料等非食用物质而导致的食品安全事故时有报道。卫生部在2008年以来就陆续发布了5批《食品中可能违法添加的非食用物质名单和易滥用的食品添加剂名单》,其中就包括碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22和酸性橙II等非食用物质，这4种属于染料，由于其着色稳定、价格低廉，被一些商家非法添加到辣椒面中以改善色泽。但长期接触这些染料可能会致癌，因此严禁将此使用于食品中。为此，建立简单、快速、准确的检测方法变得尤其重要。通过文献报道，染料类物质的检测方法主要有高效液相色谱法[1-5]、高效液相色谱-质谱法[6]等，目前关于同时测定辣椒面中碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22和酸性橙II的国标方法未见报道。本实验通过提取、离心、测试，建立了辣椒面中碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22和酸性橙II的HPLC测定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

戴安Ultimate 3000高效液相色谱仪；Chromeleon 7.0工作站 美国Thermo Fisher公司；电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；XW-80A涡旋振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 材料

碱性橙2对照品(批号：6A15G020， 98%)；碱性橙21对照品(批号：4A14K050，100%)；碱性橙22对照品(批号：6A16G050，100%)；酸性橙II对照品(批号：C1573500，德国Dr.Ehrenstorfer，96.3%)；乙腈(色谱纯，默克公司)；乙酸铵、乙酸(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；辣椒面样品(贵州省食品药品监督管理局稽查部门抽样提供)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

分别精密称取碱性橙2 对照品0.01096 g、碱性橙21对照品0.01071 g、碱性橙22对照品0.01036 g、酸性橙II对照品0.01012 g，置于100 mL量瓶中，加少量水溶解，再加50%甲醇至刻度，得到4种对照品储备液，浓度分别为107.41，107.1，103.6，97.456 μg/mL。

吸取酸性橙II储备液10 mL于100 mL量瓶中，加水至刻度摇匀，制得溶液浓度为9.7456 μg/mL。

加标实验所需的标准溶液：分别吸取碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22储备液各1.00 mL，酸性橙II储备液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加水至刻度摇匀，制得碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22和酸性橙II溶液浓度分别为4.296，4.284，4.144，1.949 μg/mL。

2.2 样品溶液的制备

准确称取5 g样品于50 mL塑料离心管中，加入10 mL 70%乙腈水溶液，超声提取20 min后，以4000 r/min离心10 min，取20 μL液相色谱测定。

2.3 色谱条件

2.3.1 色谱柱

Capcell PAK C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)。

2.3.2 流动相

A:乙腈；B：10 mmol/L 乙酸铵水溶液(乙酸0.12%)0 min→14 min(A：30%→82%)；14 min→15 min(A：82%→82%)；15 min→16 min(A：82%→30%)。

2.3.3 检测波长

酸性橙II和碱性橙2为450 nm；碱性橙21和碱性橙22为485 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min。分别吸取标准溶液和样品加标溶液注入色谱仪，其色谱图见图1。

图1 A：混合标准溶液色谱图；B:加标样品溶液色谱图Fig.1 A:The chromatogram of mixed standard solution; B:The chromatogram of spiked sample solution

2.4 方法学考察

2.4.1 碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II的线性关系考察

分别精密吸取碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II每种各1，3，5，7，9 mL于100 mL容量瓶中，制备成混合标准溶液。注入液相色谱仪，进样体积为20 μL，记录峰面积A，以峰面积A对浓度C(μg/mL)进行线性回归计算，结果见表1。

表1 碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II的回归方程、线性方程和线性范围Table 1 The regression equation, linear equation and linear range of basic orange 2, basic orange 21, basic orange 22 and acid orange II

2.4.2 精密度测试

取标准曲线第二点，即碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22标准溶液浓度为3 μg/mL，酸性橙II为0.3 μg/mL，连续进样6次，每次20 μL，测得碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II峰面积的RSD分别为0.5%，1.0%，0.8%，1.6%。结果表明：本实验所用仪器精密度良好。

2.4.3 回收率测试

准确称取5 g样品(精确至0.01 g)，共9份，置于50 mL塑料离心管中，加入标准溶液(碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22浓度分别为4.296，4.284，4.144 μg/mL)各0.25，0.5，0.75 mL，1.949 μg/mL酸性橙II各加入 0.3，1.0，1.5 mL，按2.2项下制备加标样品溶液，取20 μL样品溶液注入液相色谱仪测定,结果见表2。

表2 回收率和RSD结果表Table 2 The results of recoveries and RSDs

由表2可知，加标含量在0.1～0.6 mg/kg之间，回收率在91%～107%之间，RSD在1.1%～7.8%之间，符合食品理化检测(GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求。

2.4.4 检出限测试

准确称取5.00 g样品(精确至0.01 g)，置于50 mL塑料离心管中，加入经稀释的标准溶液(碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II的浓度分别为0.2148，0.2142，0.2072，0.1949 μg/mL)0.5，1.0，1.5 mL，按2.2项下制备样品溶液。取20 μL样品溶液注入液相色谱仪测定。记录保留时间和峰面积，当峰面积与基线噪声比值(S/N)为3时，以此时所加标的量来计算实际检出限。测得当碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II的加标浓度分别为0.1074，0.1071，0.1036，0.09745 μg/mL时，S/N为3，当称样量为5 g时，碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II的实际检出限为0.2 mg/kg。

3 讨论

最近2年，在进行国家监督抽检和省级监督抽检的辣椒面样品中，偶有发现添加非食用物质的情况，尤其是违法添加工业染料酸性橙、碱性橙等，本实验室以辣椒面为基质，探索同时检测碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II的高效液相色谱法。该方法处理简单、快速，重复性和准确度可靠，可用于辣椒面中碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、酸性橙II的含量测定，为监控辣椒面的质量提供可靠、快速的依据。

参考文献：

[1]李晶，李雪梅，徐济仓，等.超高效液相色谱法快速分离测定糖精钠、芝麻酚、酸性橙II和碱性嫩黄[J].光谱实验室，2013，30(3)：1311-1315.

[2]王荣艳，贾丽，范筱京.高效液相色谱法测定食品中非食用色素[J].食品研究与开发，2010，3(11)：164-166.

[3]范文锐，吴青，劳扬，等.高效液相色谱法同时测定食品中7种非食用色素[J].分析化学，2012，40(2)：292-297.

[4]冯然军，粟智，刘俊.高效液相色谱法同时测定功能饮料中7种禁用酸性染料[J].现代化工，2014，34(12)：158-160.

[5]徐琴，刘琳，傅余强，等.高效液相色谱法测定食品中的酸性橙II[J].食品科学，2010，31(2)：219-222.

[6]刘华良，荣维广，王联红，等.液相色谱串联质谱法检测鲍鱼汁中的酸性橙II[J].中国食品卫生杂志，2010，22(1)：16-18.