广西百色地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因特征分析*

韦红玉,隆昕颖,凌　俊,黄衍强,杨　珊,李晓华,陈源红,黄干荣,曾　怡△

(1.右江民族医学院基础医学院，广西百色 533000；2.广西壮族自治区百色市疾病预防控制中心结核科　533000；3.广西壮族自治区百色市妇幼保健院　533000)



·经验交流·

广西百色地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因特征分析*

韦红玉1,隆昕颖2,凌俊3,黄衍强1,杨珊1,李晓华1,陈源红1,黄干荣1,曾怡1△

(1.右江民族医学院基础医学院，广西百色 533000；2.广西壮族自治区百色市疾病预防控制中心结核科533000；3.广西壮族自治区百色市妇幼保健院533000)

[摘要]目的分析百色市地区结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因KatG、inhA的突变特征。方法收集128例结核病患者痰液标本，采用改良罗氏培养基分离培养结核分枝杆菌，绝对浓度法检测异烟肼耐药性，提取耐药菌株DNA，PCR扩增耐药结核分枝杆菌katG、inhA基因序列并分析异烟肼耐药相关基因突变特征。结果分离培养出98例结核分枝杆菌，34株对异烟肼耐药，耐药率为36.7%，耐药菌株KatG基因突变率为44.1%(15/34)，其中315位点突变率为66.7%(10/15)，出现两个新的突变位点为279(4/15)和427(1/15)。inhA 5位点突变率为13.3%(2/15)，inhA 16位点突变率为6.7%(1/15)，3株均为katG和inhA联合突变。结论百色地区耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性产生与katG和inhA基因突变相关，检测本地区结核分枝杆菌katG和inhA基因突变可预测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性。

[关键词]结核分枝杆菌；异烟肼；KatG；inhA

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性传染病，结核病在全球许多地区发病率再次升高[1-2]，成为增加艾滋病感染的重要因素[3]。导致结核病高发病率和病死率的重要因素之一是耐多药结核病的产生，耐多药(multidrug resistance,MDR)即至少对异烟肼和利福平同时耐药。异烟肼自1952年上市以来，一直是治疗结核病的主要药物之一，但是随着耐药结核病的出现，目前异烟肼耐药率约为17.6%[4]，且呈增长趋势。耐异烟肼结核分枝杆菌常见突变基因为katG及inhA，常见突变位点为katG315及inhA启动子区域。百色市结核病的异烟肼耐药率近年来呈上升趋势，本研究拟阐明百色市地区耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株katG及inhA基因突变特征及其与耐药的关系。为本地区耐药结核的防治和制订有效的预防及干预措施提供参考依据。

1材料与方法

1.1一般资料收集2013年在百色市疾病控制中心结核病防治所就诊的结核痰液涂片阳性患者128例(包括新发和复发患者，年龄19～88岁;男96例，女32例)的痰标本。

1.2方法

1.2.1结核分枝杆菌培养及耐药性检测痰液涂片阳性细菌采用改良的罗氏培养基分离培养，培养阳性的菌株采用绝对浓度法进行耐药性检测。

1.2.2基因组DNA提取和katG、inhA基因的PCR扩增和测序基因组DNA提取采用北京Andybio公司生产的分枝杆菌DNA提取试剂盒(柱式)提取，扩增katG基因引物：正向引物5′-GTC GGC GGT CAC ACT TTC-3′，反向引物：5′-GCT ACC ACG AAC GAC GAC-3′[5]，序列大小为660 bp；inhA基因引物：正向引物：5′-TCG CAG CCA CGT TAC GCT C-3′，反向引物：5′-CCA GCC GCT GTG CGA TC-3′[6]，序列大小为175 bp，引物由华大基因公司合成。PCR扩增采用50 μL反应体系：5.0 μL模板，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 17.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25.0 μL(购自北京全式金生物公司)。扩增程序为：95 ℃变性5 min；94 ℃变性1 min，58.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3DNA序列测定与分析PCR产物交由上海生工生物工程有限公司进行测序。用BLAST与H37RV相应基因进行序列比对，通过DNAman软件判断突变基因突变位点及形式。

2结果

2.1异烟肼耐药基因鉴定从128例痰液涂片阳性标本中分离培养获得98例结核分枝杆菌菌株，34株对异烟肼耐药。提取耐药菌株DNA进行PCR，PCR 扩增产物与目的片段大小一致，部分PCR 产物电泳图谱见图1。

2.2测序比对结果34株耐药菌株中，15株katG或inhA基因出现突变，15株katG突变位点有3个；3株inhA突变位点有2个，均属于联合突变，其中2株为katG 315与inhA 5联合突变，1株为katG 315与inhA 16，单个突变位点突变特征结果见表1。

A：1,H37RV；2～5,部分耐异烟肼菌株inhA基因PCR产物； B：1，H37RV；2～5，部分耐异烟肼菌株katG基因PCR产物；M:DNA分子标记物。

图1　　部分耐异烟肼菌株inhA、katG基因PCR电泳图

3讨论

异烟肼属前体药物，需由结核杆菌体内的过氧化氢酶-过氧化物酶激活，从而产生一系列的活性氧及活性有机自由基攻击杆菌的多个靶点，结果造成一些蛋白靶点某些基团氧化或酰化使蛋白失活，从而导致菌体一些生理功能丧失。耐异烟肼结核分枝杆菌可能与过氧化物酶的编码基因(katG)和一种与分枝菌酸生物合成有关的酶编码基因(inhA)操纵子改变有关。katG基因的变异少数是由于katG基因的全部缺失引起，大多数为katG基因的点突变，碱基的插入和缺失等。目前发现最常见的突变位点为第315位。

本实验98例结核分枝杆菌菌株出现34株异烟肼耐药，耐药率为36.7%，检测耐药菌katG及inhA基因序列，突变菌株为15株，突变率为44.1%，相比国内外众多研究结果稍低[7-9]。其中katG出现3个突变位点，315位点突变率为66.7%(10/15)，超过50%，与Hazbon等[10]研究结果无明显差异，另与深圳市报道的 68.9%无太大差异[11]，但高于浙江省报道的46.8%[12]、广东省报道的54.3%[5]及福建省报道的54.35%[13]，低于武汉报道的88.71%[14]、贵州遵义报道的92.3%[9]及Guo等[6]与陈曦等[15]的研究结果。279位点突变率为26.7%(4/15)，427位点突变率为6.7%(1/15)，这两个突变位点目前国内外尚未见报道，没有发现有katG全基因缺失的情况。3例出现inhA基因突变，占耐药突变株的20%，与吴雪琼等[16]的实验结果相同，而Hazbon等[10]的研究结果显示inhA基因突变占耐药菌株的12%，朱中元等[17]的研究结果为65%，陈杨等[9]的研究结果为30%，由此可知耐药株中inhA 基因突变具有明显的地区差异性。inhA出现2个突变位点，inhA 5位点突变率为13.3%(2/15)，inhA 16位点突变率为6.7%，突变率与陈杨等[9]的研究不同，且未检测到inhA 6、7、8、23等位点的突变，可能与研究的样本量、引物设计所覆盖片段不同及基因突变存在地区差异有关。34例耐药菌株中3例为katG和inhA双基因联合突变，占耐药菌株的8.82%(3/34)，耐药突变株的20.0%(3/15)，说明结核分枝杆菌katG和inhA基因突变与耐异烟肼相关。34例耐药株中有19例(55.9%)未出现katG和(或)inhA基因突变，说明可能还有其他基因或机制可导致结核分枝杆菌对异烟肼产生耐药性。

根据上述，虽然各地区katG基因突变率有所不同，但通过检测可知katG基因315位突变形式在我国常见，且最常见的突变形式还是点突变[18]，各地区的差异可能与标本量的采集及地域有关。本研究阐明了本地区耐异烟肼结核菌的产生主要是因为katG基因的315位点密码子发生改变，inhA基因突变也是百色地区结核分枝杆菌产生异烟肼耐药性的主要分子机制，新发现的katG 279和427突变位点与异烟肼结核分枝杆菌耐药性的相关性还有待研究。katG 315位点作为异烟肼耐药结核分枝杆菌诊断的分子标记靶点具有较好的临床应用价值。耐异烟肼结核分枝杆菌新突变位点的发现为进一步研究耐药机制及耐药结核病的快速检测提供依据，检测本地区结核分枝杆菌katG和inhA基因突变可预测结核分枝杆菌的耐药性。

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doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.031

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81071345、81160535)；广西高等学校科研项目(201204LX323)。

作者简介:韦红玉(1975-)，讲师，硕士，主要从事微生物学与免疫学研究。△通讯作者，E-mail:zengyirr@163.com。

[中图分类号]R378.911

[文献标识码]B

[文章编号]1671-8348(2016)01-0093-03

(收稿日期：2015-08-18修回日期：2015-09-12)