ITS2序列作为青风藤DNA条形码的研究

周 池，饶力群，杨 华

（湖南农业大学生物科学技术学院，道地药用植物规范化栽培与综合利用湖南省工程实验室，湖南　长沙 410128）



ITS2序列作为青风藤DNA条形码的研究

周 池，饶力群，杨 华

（湖南农业大学生物科学技术学院，道地药用植物规范化栽培与综合利用湖南省工程实验室，湖南长沙 410128）

摘 要：采用DNA试剂盒法提取采自不同地区的青风藤及其类似植物的基因组DNA，设计通用ITS2引物进行PCR扩增和测序，运用生物信息学软件对序列进行分析，从而对青风藤及其类似植物进行分子鉴定。结果表明：产地为陕西、贵州、湖北的青风藤样品序列长度分别为380～437、429～436、434～438 bp，GC含量在54.2%～55.7%，平均GC含量约为55%。青风藤及其类似植物的ITS2序列存在较大差异，且平均K2P遗传距离明显大于青风藤的种内平均K2P遗传距离。这说明内转录间隔区2（ITS2）作为DNA条形码可准确地鉴别青风藤与其他类似植物，为中药材的鉴别提供了新途径。

关键词：青风藤；内转录间隔区2（ITS2）；DNA条形码；中药材；鉴别

青风藤又名青藤、寻风藤，为防己科植物青藤、华防己或清风藤科植物清风藤等的藤茎。每年夏、秋采割藤茎，晒干即可入药，具有通络、止痛、祛风湿之功效，主治风湿及类风湿性关节炎、关节肿大、肢体疼痛、麻木等症。青风藤是一味具有较高临床药用价值的传统中药，随着风湿和类风湿病发病率的不断上升，该植物药逐渐受到国内外学者的关注。

中药鉴定是研究中药品种和质量、制定中药标准、寻找和扩大药源的前提和基础。2010年版的《中华人民共和国药典》正式将PCR技术作为中药的标准鉴定方法［1］。DNA条形码（DNA barcode）技术是分子鉴定的最新发展，即通过比较一段通用DNA片段，对物种进行快速、准确地识别和鉴定，是近年来生物分类和鉴定的研究热点，在物种鉴定方面显示了广阔的应用前景［2-4］。

真核生物基因组中，编码核糖体的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4种，它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。其中，18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守，适合于较高等级水平生物群体间的系统分析，其间的间隔区为内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1及ITS2两部分，由于进化相对迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研究，而内转录间隔区2（ITS2）已被提出作为药用植物鉴定的标准条形码序列［5-12］。研究通过对青风藤植物及其类似物的基因组提取，扩增其ITS2序列，进行测序并运用生物信息学分析，以期为青风藤植物的分类鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物样品 试验采集的植物样品见表1，通过杨华副教授初步鉴定，样品分别为防己科植物青风藤（Sinomenium acutum）、茜草科植物鸡屎藤（Paederia）、茜草科植物钩藤（Ucaria rhynchophylla）及清风藤科植物鄂西清风藤（Sabia swinhoei）。采摘样品新鲜叶片进行基因组提取，保存于-80℃超低温冰箱。从GenBank中筛选3个物种的6条ITS2作比对，见表2。

表1 样品信息

表2 从GenBank获得的植物ITS2信息

1.1.2 试验试剂 离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；TransTaq DNA polymerase High Fidelity与dNTPs（北京全式金生物技术有限公司）；参考陈士林［13］研究提出的植物ITS2通用引物，正向引物ITS2F为5'-ATGCGATACTTGGT GTGAAT-3'，反向引物ITS3R为5'-GACGCTTCTCCA GACTACAAT-3'（南京金斯瑞生物科技有限公司）。

1.1.3 试验仪器 试验主要仪器有：Biometra PCR仪（德国耶拿公司）、Gel Logic 212 Pro凝胶电泳成像系统（加拿大Carestream公司）、PowerPac电泳仪（美国BIO-RAD公司）和Centrifuge 5424型台式离心机（德国eppendorf公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 取100 mg植物叶片，用80%的乙醇反复擦拭后放入研钵，加入液氮充分研磨粉碎，按照北京天根生化科技有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒的步骤提取植物基因组DNA，用凝胶电泳检测其质量，最后储存于-20℃冰箱备用。

1.2.2 PCR扩增 PCR反应体系为50 μL，含有模板DNA 5 μL（40～50 ng），正反引物各2 μL（10 μmol/L），10×TransTaq HiFi buffer 5 μL，dNTPs 4 μL（2.5 μmol/L），TransTaq HiFi DNA polymerase 1μL，加入双蒸H2O至50 μL。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，40个循环；72℃延伸10 min，最后降温到4℃保存。产物交由铂尚生物技术有限公司纯化并测序。

1.2.3 数据处理 测序峰图用软件CodonCode Aligner V3.0校对拼接，去除不稳定区和引物区，从GenBank下载的数据则使用隐马尔可夫模型的注释方法去除两端的5.8S和28S区段，得到ITS2序列［14-15］，将所得数据导入生物信息学软件MEGA5.10分析比对并计算Kimura-2-parameter（K2P）距离，用NJ邻接法（Neighbor-2-Joining method）构建系统发育树，利用相似性搜索法（BLAST1）进行鉴定分析。利用bootstrap（1 000次）检测各分支的支持率。

2 结果与分析

2.1 相似性搜索法鉴定结果

在NCBI中使用BLAST方法对试验样品的ITS2序列进行鉴定和序列验证，结果显示试验样品与防己科植物青风藤的相似度达99%以上，这说明试验药材样品确实来源于防己科青风藤。

2.2 试验材料PCR扩增及青风藤植物ITS2序列分析

利用植物ITS2通用引物对20个样品进行PCR扩增，扩增得到的ITS2序列长度范围在380～438 bp，平均长度约428 bp，长度差异并不大（见图1）。

图1 样品DNA的ITS2序列PCR产物电泳图

对来自青风藤植物的17条带进行测序，获得了17条青风藤植物的ITS2序列，其序列GC含量在54.2%～55.7%，平均GC含量约为55%，17条青风藤ITS2序列间的变异位点在240 bp处，除GZ2样品变异为T，其他为C（见图2）；其种内的遗传距离K2P最大为0.01（见图3）。由此可知，不同产地的青风藤植物种内的ITS2序列变异极小。

从图3中还可以看出，类似植物的ITS2序列与青风藤植物的ITS2序列比对有很明显的差异，他们之间的遗传距离K2P在0.51～0.97之间（见图4），远大于青风藤植物种内的遗传距离。这说明ITS2序列可以用于青风藤植物的分子鉴定。

图2 不同产地青风藤ITS2序列变异位点比对

图3 青风藤与类似植物ITS2序列比对

图4 青风藤与类似植物的ITS2序列的遗传距离

2.3 青风藤ITS2序列与其类似物ITS2序列的聚类分析

根据试验获得的ITS2序列以及从GenBank筛选的序列，通过生物信息学软件MEGA5.10构建NJ （Neighbor-Joining）系统发育树，见图5。如图5所示，所有序列被聚为4大类。其中，防己科青风藤（Sinomenium acutum）植物由17条采集自3个不同地区的青风藤ITS2序列和GenBank筛选的2条ITS2序列聚为一类；2条茜草科植物鸡屎藤（Paederia）与钩藤（Ucaria rhynchophylla）聚为一类；湖南藤本植物园采集的鄂西清风藤（Sabia swinhoei）ITS2序列与GenBank筛选的鄂西清风藤（Sabia swinhoei）ITS2序列聚为一类；而GenBank筛选的海风藤（Piper kadsura）序列单独聚为一类。聚类结果表明，依据ITS2序列构建的分子系统树可以将青风藤植物与其类似植物很好地区分开来。

图5 NJ系统发育树（bootstrap 1 000次重复，显示支持率≥50%的分支）

3 讨 论

近年来，随着风湿和类风湿病发病率的不断上升，青风藤植物受到人们的广泛关注，但传统的形态分类鉴别并不能完全区分各种混伪品。随着分子生物学技术的不断发展，已有研究通过各种方法对青风藤的遗传多样性进行分析［16-17］，但在种间、种内显示出的多态性程度并不完全一致，且各种分子标记技术之间缺乏一定的相互印证。基于遗传物质DNA的条形码鉴定技术，具有稳定、可靠、不受外界影响的特点，是一种新的分子生物鉴定技术。

该研究应用DNA条形码技术测定了防己科青风藤的ITS2序列。研究结果表明，ITS2序列在不同物种的个体间存在丰富的变异，ITS2序列种内的K2P遗传距离比较接近，说明其种类的相似度高，亲缘关系较近；ITS2序列在系统发育树中的支持率也较高，说明了采用ITS2序列的鉴定方法能够从分子角度区分青风藤植物与其他类似植物。

中药医学一直是中国现代医学的重要组成部分，而中药材原材料的真伪鉴定一直是中国中药材研究人员的一大难题，传统的基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等方法在某些方面都有局限性。该研究结果验证了ITS2序列在中药材中的鉴别能力，对于实现中药材分子水平的快速鉴定具有重要意义，也能为中药资源在起源和进化方面的研究提供参考。

参考文献：

［1］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）［M］. 北京：中国医药科技出版社，2010. 72-73.

［2］ 陈士林，姚 辉，宋经元，等. 基于DNA barcoding（条形码）技术的中药材鉴定［J］. 世界科学技术-中医药现代化，2007，（3）：7-12.

［3］ Li D Z，Liu J Q，Chen Z D，et al. Plant DNA barcoding in China［J］. Journal of Systematics and Evolution，2011，49：165-168.

［4］ Li M，Cao H，But P P H，et al. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcode［J］. Journal of Systematics and Evolution，2011，49：271-283.

［5］ Chen S L，Yao H，Han J P，et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species［J］. PLOS One，2010，5（1）：e8613.

［6］ 罗 焜，陈士林，陈科力，等. 基于芸香科的植物通用DNA条形码研究［J］. 中国科学（生命科学），2010，（4）：342-358.

［7］ 朱英杰，陈士林，姚 辉，等. 重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究［J］. 药学学报，2010，（3）：376-382.

［8］ Gao T，Yao H，Song JY，et al. Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2［J］. Journal of Ethnopharmacology，2010，130（1）：116-121.

［9］ Pang X H，Song J Y，Zhu Y J，et al. Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification［J］. Cladistics，2011，27（2）：165-170.

［10］Yao H，Song J Y，Liu C，et al. Use of ITS2 Region as the Universal DNA Barcode for Plants and Animals［J］. PLoS ONE，2010，5（10）：e13102.

［11］Gao T，Yao H，Song J Y，et al. Evaluating the Feasibility of Using Candidate DNA Barcodes in Discriminating Species of the Large Asteraceae Family［J］. BMC Evol Biol，2010，10（2）： 1-7.

［12］Pang X H，Song J Y，Zhu Y J，et al. Using DNA barcoding to identify species within Euphorbiaceae［J］. Planta Med，2010，76（15）：1784-1786.

［13］陈士林，姚 辉，韩建萍，等. 中药材DNA条形码分子鉴定指导原则［J］. 中国中药杂志，2013，（2）：141-148.

［14］Eddy S R. Profile hidden Markov models［J］. Bioinformatics，1998，14：755-763.

［15］Keller A，Schleicher T，Schultz J，et al.5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation［J］. Gene，2009，430（1-2）：50-57.

［16］李 松，孙利生，唐 锴. 青风藤及其伪品的鉴别［J］. 首都食品与医药，2015，（13）：57.

［17］李亚玲，叶 云，余德智. 防己及其混伪品的鉴别方法［J］. 国际中医中药杂志，2012，34（1）：37-41.

（责任编辑：成 平）

Research of ITS2 Sequences as Caulis Sinomenii DNA Barcode

ZHOU Chi，RAO Li-qun，YANG Hua
（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Hunan Engineering Laboratory for Good Agricultural Practice and Comprehensive Utilization of Famous-Region Medicinal Plants， Changsha 410128， PRC）

Abstract：Using DNA Kit Method to extract genomic DNA from the Caulis Sinomenii and similar plants in different regions， the design of universal ITS2 primers for PCR amplification and sequencing， using bioinformatics software to analyze the sequence， then carried out the molecular identification to Caulis Sinomenii and similar plants. The results showed that the sample sequence length of Caulis Sinomenii in producing area of Shanxi， Guizhou， Hubei respectively were 380～437， 429～436， 434～438 bp and the GC content in 54.2%～55.7%，average GC content was about 55%. There was a big difference between ITS2 sequences of Caulis Sinomenii and similar plants， the average genetic distance of K2P was significantly greater than the intraspecific average K2P genetic distance. This illustrated the internal transcribed spacer 2 （ITS2） as a DNA barcode can accurately identify Caulis Sinomenii and other similar plants， it provided a new way for the identification of Chinese herbal medicine.

Key words：Caulis Sinomenii； internal transcribed spacer 2 （ITS2）； DNA barcode； Chinese herbal medicine； identify

中图分类号：R282.5

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2016）05-0001-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.05.001

收稿日期：2016-03-29

基金项目：湖南省2014年科技创新项目（湘发改投资［2014］658号）

作者简介：周 池（1991-），男，湖南常德市人，硕士研究生，主要从事生物资源开发与利用研究。

通讯作者：饶力群