茯苓多糖的提取工艺优化

刘 欣，熊芳琪，余倩莎，张 城，唐 娟，彭国平

（湖南农业大学生物科学技术学院，道地药用植物规范化栽培与综合利用湖南省工程实验室，湖南　长沙 410128）



茯苓多糖的提取工艺优化

刘 欣，熊芳琪，余倩莎，张 城，唐 娟，彭国平

（湖南农业大学生物科学技术学院，道地药用植物规范化栽培与综合利用湖南省工程实验室，湖南长沙 410128）

摘 要：为了改进茯苓多糖的提取工艺，以茯苓粉为原料，通过对NaOH浓度、反应温度、反应时间、料液比4个因素进行正交试验，探讨了茯苓多糖提取的优化条件。结果表明：茯苓多糖提取的最优制备工艺为：反应时间8 h，碱浓度0.7 mol/L，料液比1∶30，反应温度5℃。

关键词：茯苓；茯苓多糖；提取工艺；优化

茯苓味甘、淡，性平，主产于安徽、云南和湖北。茯苓中绝大部分组分是多糖，含量达到93%以上。目前有关茯苓多糖提取工艺的研究很多［1-3］，通常采用水提和碱提两种方法分别提取水溶性茯苓多糖和碱溶性茯苓多糖。因茯苓多糖大多为碱溶性，所以碱提法更常用，但强碱有可能打断多糖的糖苷键，从而引起多糖降解。研究考察了提取碱浓度、提取温度、料液比、提取时间等因素对茯苓多糖提取率的影响，优化了碱溶性茯苓提取工艺条件，旨在为碱溶性茯苓多糖的推广应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验材料与试剂 茯苓粉菌核（湖南省靖州县茯苓协会茯苓基地）。无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖、乙醚、丙酮、冰醋酸均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2 试验仪器 紫外-可见分光光度计（Agilent 8453，美国安捷伦科技公司）、旋转蒸发仪（R-1001N，郑州长城科工贸有限公司）、冷冻高速离心机（5417R，德国Eppendorf公司）、傅里叶红外光谱仪（Vector，德国布鲁克仪器公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 前期处理 将采集的茯苓菌核洗净，切成块，放在烘箱中50℃烘干72 h。将烘干的茯苓菌核体用中草药粉碎机粉碎至粉末状。过20目筛，封存、备用。然后，准确称取一定量干燥茯苓菌核粉末，加入80%乙醇，持续搅拌20 min，离心，收集残渣，依此过程重复脱脂3次，干燥，备用。

1.2.2 多糖的提取条件单因素试验 用碱溶液处理水提后的茯苓渣，分别用5倍量的碱液浸提，搅拌均匀，此时溶液呈黄棕色透明粘稠状，置于4℃过夜，抽滤得上碱液，把渣再用3倍量碱液提取一次，所得碱液合并，抽滤，用Sevage法除蛋白，重复3次以上，滤液以10%醋酸液中和至pH值为6，此时溶液变成白色胶体状，再加入3倍量的95%乙醇，于4℃放置过夜，抽滤得沉淀，45℃恒温干燥，得到碱溶性茯苓多糖，备用［4］。

（1）NaOH浓度处理试验：固定反应温度为5℃、反应时间为12 h、料液比为1∶30，NaOH浓度梯度为：0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 mol/L，测定不同NaOH浓度处理下碱溶性茯苓多糖的提取率。

（2）温度处理试验：固定反应碱浓度为0.8 mol/L、反应时间为12 h、料液比为1∶30，温度变化梯度为：5、15、25、35和45℃，测定不同温度处理下碱溶性茯苓多糖的提取率。

（3）时间处理试验：在反应碱浓度为0.8 mol/L、反应温度为5℃、料液比为1∶30条件下，处理时分别为：2、4、6、8、10和12 h，测定不同时间处理下的碱溶性茯苓多糖的提取率。

（4）料液比处理试验：在反应碱浓度为0.8 mol/L、反应温度为5℃、反应时间为12 h条件下，料液比变化梯度为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，测定不同料液比处理下碱溶性茯苓多糖的提取率。

1.2.3 正交试验 参照文献总结多种提取方法及探索性实验的结果［5-8］，根据单因素试验结果，每个因素确定3个水平之后，以茯苓多糖提取率作为考察指标进行正交试验，用SPSS软件对正交试验结果进行分析，从而确定茯苓多糖提取的最优条件。

1.2.4 正交试验验证 按照正交试验得到的茯苓多糖提取的最优条件对茯苓干粉进行提取处理，测定其多糖提取率，并与正交试验中各组结果进行比较。

1.2.5 多糖含量的测定 采用蒽酮比色法［9］测定茯苓多糖的含量。

1.2.6 茯苓多糖脱蛋白 利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与Sevage试剂5∶1混合，振荡20 min左右，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处，重复多次，直至除尽蛋白质。此法的优点是条件温和，不会引起多糖的变性。

1.2.7 茯苓多糖红外光谱分析 参照茯苓多糖红外光谱分析的相关文献［10-12］确定红外光谱方法：茯苓多糖干粉，采用KBr压片法，扫描范围400～4 000 cm-1。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

由图1可知，葡萄糖的标准曲线为y=29.502x-0.006 9，R2=0.997 9。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2单因素对茯苓多糖提取的影响

2.2.1 不同NaOH浓度对碱溶性茯苓多糖提取的影响表1结果表明，NaOH浓度对茯苓多糖的提取率影响较显著，高浓度NaOH条件下，茯苓多糖的提取率更高，更加有利于茯苓多糖的提取。茯苓多糖在NaOH浓度为0.3～0.9 mol/L条件下提取率有明显的差异，其中0.3 mol/L条件下多糖提取率很低，0.4 mol/L时，多糖提取率提升幅度较大，而从0.5～0.9 mol/L处理下的多糖提取率稳步上升，但是上升幅度并不大，这说明，NaOH浓度为0.4 mol/L是茯苓多糖提取率变化的拐点。因此，高浓度NaOH有利于茯苓多糖的提取，但是浓度过高可能会导致多糖性质发生改变。

表1 NaOH浓度对碱溶性茯苓多糖提取率的影响

2.2.2 不同反应温度对碱溶性茯苓多糖提取的影响表2结果表明，反应温度对茯苓多糖的提取率影响较显著，低温条件下，茯苓多糖的提取率更高。茯苓多糖在温度为5℃～45℃条件下提取率稳步下降，并且下降幅度均有明显差异，这说明，温度为5℃是茯苓多糖提取的适合温度。因此，低温条件有利于茯苓多糖的提取。

表2 反应温度对碱溶性茯苓多糖提取的影响

2.2.3 不同反应时间对碱溶性茯苓多糖提取的影响表3结果表明，反应时间对茯苓多糖的提取率影响不明显，反应2 h后，多糖提取率的变化不大。因此，反应时间对茯苓多糖的提取影响不大，为了使试验效率更高，可以在多糖提取处理的时间上进行缩短，根据试验时间安排控制在适合的范围下即可。

2.2.4 不同料液比对茯苓多糖提取的影响 表4结果表明，料液比对茯苓多糖的提取率影响较显著，料液比小的条件下，茯苓多糖的提取率更高，更加有利于茯苓多糖的提取。茯苓多糖在料液比为（1∶10）～（1∶50）条件下提取率有明显的差异，其中1∶10条件下多糖提取率很低，1∶20时，多糖提取率提升幅度较大，而1∶30～1∶50条件下多糖提取率稳步上升，但是上升幅度并不大，这说明，料液比为1∶20是茯苓多糖提取率变化的拐点。因此，料液比小有利于茯苓多糖的提取，但是处于节约成本考虑，尽量控制料液比在（1∶30）～（1∶50）范围内。

表3 反应时间对碱溶性茯苓多糖提取率的影响

表4 料液比对碱溶性茯苓多糖提取率的影响

2.3 茯苓多糖提取工艺正交试验

通过对茯苓多糖提取的单因素影响的探索，选取反应时间、碱浓度、料液比3个单因素进行正交试验（表5），并对试验结果进行极差分析（表6）和方差分析（表7）从而确定茯苓多糖提取的最优条件。

表5 碱溶性茯苓多糖提取率的因素水平

表6 碱溶性茯苓多糖提取率正交试验

表7 正交试验方差分析

根据极差分析及最优条件确定：碱溶性茯苓多糖提取条件最优水平组合是A2B3C1，即反应时间8 h，碱浓度0.7 mol/L，料液比1∶30，反应温度5℃。表6中的反应时间、碱浓度、料液比3个因素的Ⅲ型平方和依次为：0.006、0.002、0.003，碱浓度的P值小于0.01，说明碱浓度对多糖提取率的影响极显著，进一步证明了前面的结论。

2.4 正交试验验证结果

按照正交试验所得结果以反应时间8 h，碱浓度0.7 mol/L，料液比1∶30，反应温度5℃的条件进行茯苓多糖的提取，测定其提取率分别为：71.46%、70.63%、72.77%，平均值为71.62%，大于正交试验中任意一组的多糖提取率，因此认为正交试验结果为茯苓多糖提取率最优条件。

2.5 茯苓多糖红外光谱分析

由茯苓多糖样品红外光谱（图2）可知：在1 650 cm-1有一水合物吸收峰，在3 600～3 000 cm-1（S，O-H）、2 900 cm-1（m，C-H）、1 200～1 000 cm-1（S，C-O-C，C-OH）等处有多糖的特征吸收峰，在840 cm-1附近有可以表明存在α-糖苷键的吸收峰。

图2 茯苓多糖样品红外光谱分析

3 讨论与结论

从碱浓度、提取时间、料液比、反应温度对碱性茯苓多糖提取率的影响可知，影响的大小依次为：碱浓度、提取时间、提取温度、料液比。为了提高碱性茯苓多糖得率，可以适当提高碱浓度，但过高的浓度，会导致茯苓多糖结构的破坏。裂解强度要适中，避免大量生成羧甲基低聚糖或者单糖，影响茯苓多糖的提取率。

单因素试验结果表明：碱浓度在0.4 mol/L之前，提取率很低，0.4～0.9 mol/L呈上升趋势，但当NaOH浓度达到0.7 mol/L之后，提取率的增幅变小，考虑到多糖在强碱环境下容易出现结构破环的情况，因此把碱浓度控制在0.7 mol/L左右为宜；随着反应温度的提高，茯苓多糖的提取率在下降，在45℃以上之后，提取率变得很低，在5℃反应下有最高值；随着反应时间增加，提取率逐渐增高，但8 h以后出现提取率降低的现象；随着反应料液比升高，提取率逐渐增高，在反应料液比达到1∶30以上后，提取率增长缓慢。正交试验结果表明，反应时间8 h，碱浓度0.7 mol/L，料液比1∶30，反应温度5℃为研究中最优的茯苓多糖提取条件。

此外，茯苓多糖的干燥要注意：温度不能太高，高温条件下干燥，会使得茯苓多糖板结，将干燥温度控制在50℃左右为最佳。

参考文献：

［1］ 张晓娟，唐 洁，梁引库，等. 茯苓多糖的提取纯化及应用研究进展［J］. 时珍国医国药，2008，（12）：2946-2949.

［2］ 胡烜红. 茯苓多糖提取工艺及质量控制研究［D］. 成都：西南交通大学，2012.

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［5］ 李 悦，吴和珍，叶丛进，等. 蜗牛酶辅助降解茯苓多糖工艺优化研究［J］. 亚太传统医药，2016，（4）：53-55.

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［7］ 袁勤洋，卢 静，曲彩红，等. 茯苓多糖的提取方法及提取工艺优化研究概况［J］. 临床合理用药杂志，2014，（16）：195-196.

［8］ 汤 进. 道地药材云苓多糖成分的研究［D］. 武汉：武汉轻工大学，2014.

［9］ 朱 伟. 蒽酮-硫酸比色法测定香菇多糖含量［J］. 北方药学，2011，（8）：8-9.

［10］刘文杰. 铁皮石斛的红外光谱定性定量研究［D］. 北京：北京中医药大学，2014.

［11］徐韧博. 松塔多糖的分离纯化、结构鉴定及抗氧化活性研究［D］.哈尔滨：哈尔滨工业大学，2013.

［12］郭咪咪. 紫薯多糖的分离纯化及抗氧化性研究［D］. 洛阳：河南科技大学，2013.

（责任编辑：夏亚男）

Optimization of Fuling （Poria coccus） Polysaccharides Extraction Technology

LIU-Xin，XIONG Fang-qi，YU Qian-sha，ZHANG Cheng，TANG Juan1，PENG Guo-ping
（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Hunan Engineering Laboratory for Good Agricultural Practice and Comprehensive Utilization of Famous-Region Medicinal Plants， Changsha 410128， PRC）

Abstract：In order to improve the tuckahoe polysaccharide extraction process， taking tuckahoe powder as raw material， four factors orthogonal test was conducted to optimize Poria cocos polysaccharide extraction conditions by NaOH concentration， reaction temperature，reaction time and material liquid， The results showed that the Indian buead polysaccharide extraction of the optimum preparation process for 8 h reaction time， concentration of alkali 0.7 mol/L， 1∶30 material liquid ratio， reaction temperature of 5 ℃ conditions of Poria cocos polysaccharide extraction.

Key words：Poria cocos； Indian buead polysaccharide； extracting process； optimization

中图分类号：TQ461

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2016）05-0085-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.05.024

收稿日期：2015-11-16

作者简介：刘 欣（1990-），男，湖南岳阳市人，硕士研究生，主要从事中药多糖的提取与分离研究。

通讯作者：彭国平