双黄连逆转肺炎克雷伯菌耐药的体内效果初探

肖雪琴,赖　剑,罗耀玲,王华彬,方玉兰,黄淑芳

(赣南医学院第一附属医院　1.儿科;2.胃肠外科;3.科研中心，江西　赣州　341000)



双黄连逆转肺炎克雷伯菌耐药的体内效果初探

肖雪琴1,赖剑2,罗耀玲3,王华彬1,方玉兰1,黄淑芳1

(赣南医学院第一附属医院1.儿科;2.胃肠外科;3.科研中心，江西赣州341000)

摘要：目的:探讨双黄连逆转肺炎克雷伯菌耐药的体内效果。方法：建立耐药的SD大鼠肺炎克雷伯菌模型；再随机分4个治疗组：PBS组、双黄连组、头孢他啶组及联合治疗组；治疗3天后观察各组临床表现，并测定各组大鼠肺内活菌数，以及这些活菌对头孢他啶的药敏效果。结果：临床表现和病理切片结果表明耐药肺炎克雷伯菌大鼠建模成功；各组治疗结果表明，联合治疗组大鼠在临床表现上痊愈，肺内活菌数及活菌的MIC与两个单独治疗组和PBS对照组相比显著减少(P<0.01)，而两个单独治疗组的大鼠在临床表现上基本无好转，肺内活菌数及活菌的MIC与PBS组相比相对减少，差异不大。结论：中药双黄连可降低肺炎克雷伯菌大鼠的耐药。

关键词：双黄连；耐药肺炎克雷伯菌；逆转

小儿肺炎是儿科最常见的呼吸系统疾病，易反复发作和引起多种严重的并发症，影响儿童发育[1]。小儿肺炎的病原体主要为细菌、病毒、支原体和衣原体，我国以细菌感染为主[2]，其中60%以上是革兰阴性菌，25%～30%为革兰阳性菌。革兰阴性菌中以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌为主[3-4]，为此课题选择克雷伯菌作为实验菌株。近年来由于抗生素的广泛使用甚至滥用，使细菌在这种持续胁迫的选择压力下，产生了严峻的耐药现象。研究显示肺炎克雷伯菌对多种抗生素尤其是碳青霉烯类抗生素有非常严重的耐药现象[5],为此不少研究者将目光投向了耐药逆转剂上。 近年来，一些学者[6-8]将中药作为逆转剂逆转抗生素耐药，在体外研究上取得了良好的效果，然而并未做过体内实验。本课题选择中药双黄连作为逆转剂，研究其对耐头孢他啶的肺炎克雷伯菌的体内逆转效果。现报告如下。

1材料与方法

1.1材料头孢他定药敏片(英国OXOID)，M-H培养基(英国OXOID)。双黄莲粉针剂(哈药集团中药二厂)，头孢他定(Glaxo Smithkline公司，批号C076348，纯度89．4%)。

1.2耐药菌株的来源和培养选择赣南医学院第一附属医院临床分离的耐药肺炎克雷伯菌株(用头孢他定药敏片进行药敏实验，抑菌圈直径≤22 mm的菌株，定为耐药菌株)。将菌株划线于M-H琼脂培养基上37 ℃大量培养过夜，用PBS冲洗菌台并稀释调配成1×109CFU·mL-1备用。

1.3SD大鼠肺炎模型的建立和验证[9]选择清洁级SD大鼠30只，雌雄各半，体重130～180 g(由赣南医学院动物中心提供)。大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，鼻部缓缓滴入约1×109CFU·mL-1肺炎克雷伯菌30 μL，分2次接种，大鼠保持直立体位20 s，以确保菌液顺利进入肺部组织。观察感染12 h、24 h大鼠的临床表现，并与感染24 h后从中随机挑选3只处死进行肺组织病理学检测。

1.4肺部感染的SD大鼠分组与治疗将SD肺炎大鼠随机分4组，每组6只，分别为：PBS对照组、头孢他定治疗组、双黄连组、头孢他定与双黄连联合治疗组；双黄莲按23 g·L-1,头孢他啶200 mg·kg-1，每只分别灌胃0.5 mL；对照组灌胃给予等量的PBS，每天灌胃2次，时间间隔为6～8 h，连续治疗3天。记录各组大鼠临床表现。

1.5细菌计数最后一次治疗后12 h处死鼠，取双肺，PBS冲洗3次，置匀浆器中加入2 mL PBS研磨15 min，制成肺组织匀浆。采用10×倍比稀释肺组织匀浆，依次取各浓度100 μL接种M-H琼脂培养基上，37 ℃恒温孵育24 h，选取菌落在20～200个之间的平板进行菌落计数。

1.6药敏实验测定MIC选择1.5步骤中各组活菌，每管细菌最终接种量为1×106CFU·mL-1，采用试管2倍稀释法测定头孢他啶对各组活菌的最小抑菌浓度(MIC)。

2结果

2.1肺炎克雷伯菌大鼠模型验证SD大鼠感染肺炎克雷伯菌临床表现可见：12 h时，大鼠出现烦躁、活动增强，体温升高达39.4 ℃；感染24 h时，大鼠出现蜷缩不动、呼吸缓慢、弓背、反应迟钝、皮毛蓬松、食欲下降、摄食差。 病理学检测： 感染24 h的SD大鼠与未感染的SD大鼠相比，病理切片显示： 感染的大鼠肺间隔变宽，肺泡变的不规则，很多出现融合断裂。高倍镜显示：支气管周围、肺泡壁充血，见图1。

A.感染的肺部组织B.未感染的正常肺部组织

图1 SD大鼠肺部组织病理切片图

2.2治疗3天后各组SD大鼠的临床表现PBS组于治疗第二天死亡2只，未死亡大鼠蜷缩饲养笼不动，眼睛紧密；双黄连组和头孢他啶组大鼠皮毛仍蓬松、食欲仍不佳，体温仍很偏高，约38.5 ℃，精神略好转；联合治疗组的大鼠毛发已有光泽，食欲大好，体温正常。

2.3细菌计数结果每100 μL中细菌计数结果如图2：PBS组为(13.5±2.38) CFU,双黄连组为(9.33±1.36) CFU，头孢他啶组为(10±1.41) CFU，双黄连与头孢他啶联合组为(3.67±1.21) CFU，方差分析结果表明，三个治疗组与PBS对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；双黄连组和头孢他啶组相比，治疗效果无统计学差异(P=0.468)；联合治疗组与两个单独治疗组相比，差异显著(P<0.01)。

图2细菌计数

2.4MIC测定结果见表1。双黄莲与头孢他啶联合治疗组MIC明显比其他治疗组低(P<0.01)，可见双黄连可降低头孢他啶的MIC，逆转肺炎克雷伯菌的耐药。

表1　头孢他啶对各组肺炎克雷伯菌的MIC

*与其他各组比较，P<0.01。

3 讨论

降低肺炎克雷伯菌耐药，使其全部或部分恢复对抗生素的敏感性，对临床治疗肺炎有重要的意义，肺炎克雷伯菌耐药的主要原因是它利用固有耐药基因或从外源获得的耐药基因通过以下5种方式产生耐药：(1) 产生灭活酶或钝化酶；(2)通过膜上某种蛋白发生改变使抗生素出现渗透障碍；(3)通过改变靶位酶，使其不被抗生素所作用；(4)通过主动外排系统，将药物泵出细胞外；(5)通过增加对抗菌药物拮抗物的产量而耐药。科研工作者根据这些耐药机制研究逆转剂，早期开发了β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸(clavulanic acid)，舒巴坦(sulbactam)来逆转耐药，然而这些逆转剂会再次产生耐药，并促进超级耐药菌的产生。

近年来研究表明中药可以从不同方面抑制耐药，并且不易产生耐药性，如黄芩可以抑制β-内酰胺酶产生[6]，大黄可消除金葡菌抗生素耐药质粒[10]；因此开发中草药作为细菌耐药的逆转剂具有广阔的应用前景。

本课题选择双黄连粉针剂(主要成分为金银花、黄芩、连翘，具有清热解毒功效)作为逆转剂，研究其对耐肺炎克雷伯菌大鼠的逆转效果。为了避免中药的抑菌作用，单纯考虑双黄连对细菌的逆转效果，课题中双黄连和头孢他啶的治疗剂量均为略低于最小抑菌量(由预实验确定)。实验中治疗3天后，双黄连和头孢他啶治疗组大鼠在临床表现上基本没什么好转，而联合治疗组大鼠痊愈；细菌计数结果则表明双黄莲和头孢他啶联合治疗组比两个单独治疗组细菌数明显降低；这些结果均表明双黄连可以逆转肺炎克雷伯菌对头孢他啶的耐药。

中药逆转抗生素耐药体外效果明显，本课题初步研究发现体内效果也很明显。随后我们将通过进一步的研究给予确认，并进行耐药机制的研究。

参考文献：

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[2]利汉其,廖友明,张广昭.小儿肺炎的病原学研究[J].中华全科医学,2011,9(1):56-57.

[3]李自华,方玉蓉,胡振,等.520例小儿肺炎痰液病原菌分布及耐药性分析[J].临床肺科杂志,2013,18(8):1441-1442.

[4]钟和悦,冯宁益.小儿肺炎480例痰液细菌培养及耐药性分析[J].广东医学,2010,31(6):770-771.

[5]刘衍伶,胡龙华,钟桥石,等.碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌的分布及耐药特性分析[J].中国急救医学，2015,35(5)：426-429.

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[9]庞露，肇丽梅，于莹，等．左氧氟沙星对肺炎克雷伯菌感染小鼠的治疗作用[J].中国医院药学杂志，2012,32：173-175.

[10]陈小英．大黄对金黄色葡萄球菌抗生素耐药质粒的消除作用[J].南京药学院学报，1985，16(2)：48-52.

Study on Reversal of Effect of Double Coptis in Vivo on the Resistance of Klebsiella Pneumoniae

XIAOXue-qin1,LAIJian2,LUOYao-ling3,WANGHua-bin1,FANGYu-lan1,HUANGShu-fang1

(1.Dept.ofPediatrics;2.Dept.ofGastrointestinalSurgery;3.ScientificResearchCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Abstract:Objective:To investigate the reversal of effect of double copyis in vivo on the resistance of Klebsiella pneumoniae.Methods:SD rat model with pulmonary infection induced by Klebsiella pneumordae(Kp) was set up. Then, rats were divided into four groups randomly which were PBS cintrol group, shuanghuanglian group，ceftaxime group and the combined group.The clinical manifestations of the rats in each group were observed 3 days after treatment; the number of viable bacteria in the lung of the rats and the drug sensitivity of these alive bacteria were determined. Results:The clinical manifestations and pathological sections showed that the rat modal of the drug resistant Klebsiella pneumoniae was set up successfully. The results of treatment in each group showed that the rats in the combined treatment group were cured, and the number of viable bacteria in lung and MIC of alive bacteria was significantly decreased compared with the control group (P<0.01). Conclusion: Chinese medicine Shuanghuanglian can reduce the drug resistance of Klebsiella pneumoniae in rats.

Key words:shuanghuanglian;resistant Klebsiella pneumoniae;reverse

中图分类号：R965

文献标志码：A

文章编号：1001-5779(2016)02-0190-03

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.007

(收稿日期：2015-06-10)(责任编辑：刘仰斌)