外源一氧化氮NO对铁皮石斛类原球茎生长及多糖积累的影响

蒋天仪+卓宇+唐敏+王波

摘要：通过添加不同浓度的一氧化氮（NO）供体硝普钠（SNP）处理铁皮石斛类原球茎，研究外源NO对铁皮石斛类原球茎生长发育、多糖合成的影响。结果表明：低浓度SNP有利于铁皮石斛类原球茎生长和多糖含量的提高，而高浓度的SNP则表现出抑制作用。综合看来，0.5 mmol/L SNP效果最佳，其中干质量比对照组高36.90%，叶绿素a含量提高了17.81%，叶绿素b含量提高了12.17%，总叶绿素含量提高了14.91%，多糖产量提高了51.22%；NO专一性猝灭剂cPITO抑制了SNP的这种促进作用，说明NO参与了铁皮石斛类原球茎生长和多糖合成的调控，从而影响其生长发育和次生代谢产物的合成。

关键词：铁皮石斛；类原球茎；一氧化氮；硝普钠；多糖；叶绿素a；叶绿素b；总叶绿素

中图分类号： S567.23+9.04

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0257-03

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属多年生附生草本植物，是我国传统名贵药材，具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖和养阴生津等多种生物活性[1]。现代研究表明，多糖是铁皮石斛的主要化学成分[2]，其水溶性多糖含量高达22.7%[3]，石斛生理活性的强弱与其多糖含量密切相关。此外，铁皮石斛也具有一定的观赏价值，其花色艳丽，可作为一种小型盆栽观赏[4]。但是由于铁皮石斛生长条件的特殊性和分布的局限性，又经过长期采挖，导致其自然资源濒临枯竭，国内市场供应紧缺。近年来，铁皮石斛的组织培养技术已经很成熟，组织培养从细胞到微苗、幼苗、壮苗，虽然缩短了自然生长周期，但是最短也要1～2年时间[5]，其优质种苗的来源和供应已经成为制约铁皮石斛生产发展的“瓶颈”。何铁光等研究证明，铁皮石斛类原球茎的多糖含量与野生品相近，且其药理作用相同，从而证明可以直接培养类原球茎来代替全植株提取药源[6]。

NO作为气体信号分子，参与植物的多种生理代谢过程。樊洪泓等用外源NO供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）处理霍山石斛发现，NO可以提高光合系统的光能转换效率和潜在活性[7]。随后金青等研究表明，外源NO促进了杂交石斛类原球茎中生物碱的合成与积累[8]。周永斌等用不同浓度的SNP处理豌豆、黄瓜、玉米、刺槐种子及其砂培幼苗时发现，一定浓度的SNP对种子发芽势、发芽率及幼苗的根长、叶绿素含量和生物量有明显的促进作用[9]。后来刘建新等也发现，适宜浓度的SNP可促进黑麦草种子的发芽率、幼苗干物质积累速率及叶绿素含量的提高[10]。Modolo等以NO处理大豆，发现外源NO可以提高大豆组织中黄酮、异黄酮类物质的含量[11]。徐茂军也有类似研究报道，外源NO对紫杉醇的生物合成具有促进作用[12]。以上研究表明，外源NO能够促进植物的生长，并对植物次生代谢产物的合成具有一定作用。

本试验通过外源NO对铁皮石斛类原球茎的处理，探讨对其生长发育及多糖积累的影响，并试图寻找适宜的外源NO浓度来增加铁皮石斛类原球茎的产量和药用成分含量。从而利用铁皮石斛类原球茎生产目的产物，缩短周期，降低成本，提高生产效率，满足市场需求，为提高铁皮石斛的药用工厂化生产可行性提供一定的实践和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用材料是从云南西双版纳药用植物研究所引进的铁皮石斛无菌苗。铁皮石斛类原球茎由无菌苗茎段诱导而来，经过30～40次继代培养，每30 d继代1次，具有稳定的形态特征和生长速率。培养条件：无菌培养室昼温/夜温为25 ℃/15 ℃，昼/夜光照时间为14 h/10 h，光照度 2 000 lx。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基备制 以MS为基本培养基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，pH值5.8。在121 ℃高温高压灭菌锅内持续灭菌17 min。

1.2.2 材料处理 添加不同浓度的NO供体硝普钠和一定浓度的NO专一性猝灭剂cPITO（2-4-carboxyphenyl-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide）处理铁皮石斛类原球茎。试验设计见表1，共有4个不同浓度的SNP处理，对应加入一定浓度的cPTIO来验证是否为外源NO起作用。以正常条件下培养的类原球茎为对照（CK），共6个处理，每个处理3次重复。SNP、cPITO溶液经0.22 μm过滤膜进行过滤灭菌加入到灭菌后的培养基中，事先准备好待用。每个处理20瓶，每瓶接入准确称量的2.0 g铁皮石斛类原球茎，在超净工作台进行接种。放入光周期12 h/d、光照度2 000 lx、培养温度（25±1） ℃的培养架上培养。在处理后第30天进行各项指标的测定。

T5为本试验的验证试验处理，试验最后得出的最适的外源SNP浓度为0.5 mmol/L，对应加入1 mmol/L cPTIO。

1.3 指标测定

1.3.1 生物量测定 取出各处理的铁皮石斛类原球茎，洗净培养基，用滤纸吸干水分后称取其鲜质量，然后在烘箱中于105 ℃杀青20 min，后于60 ℃烘48 h至恒质量，称取其干质量。

1.3.2 叶绿素测定 参见李合生的丙酮浸提法[13]测定叶绿素含量。取不同处理的铁皮石斛原球茎鲜样0.1 g放入 10 mL 离心管中，加入5 mL 80%丙酮溶液，在黑暗条件下浸提48 h直至完全变白，取上清液在645、663 nm下测定吸光度D645 nm、D663 nm。鲜质量含量M单位为μg/g。用以下公式计算出溶液中叶绿素a、b、a+b的含量与鲜质量含量：

1.3.3 多糖的提取及含量测定

1.3.3.1 多糖的提取 采用叶余原的超声法[14]提取多糖。将测过干质量的原球茎干品研磨过40目筛，称取干品粉末约0.1 g，用滤纸包好，置于三角瓶中，依次用石油醚（60 ℃）、80%乙醇（80 ℃）在水浴锅中回流提取去除干扰杂质成分，而后取出样品置于105 ℃烘箱中干燥（约30 min）。将原球茎粉末洗进试管中，每管加入10 mL超纯水，放入KQ-300GVDV型三频恒温数控超声波清洗器中，用超声波水浴加热提取。超声功率恒定为300 W，温度为80 ℃，持续提取 4 h。

1.3.3.2 多糖含量的测定 多糖的测定采用苯酚硫酸法[15]，以葡萄糖为对照。（1）标准曲线的制备。准确称取 20 mg 标准葡萄糖于500 mL容量瓶中，加水定容，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL溶液，各以蒸馏水补至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚、5.0 mL浓硫酸，摇匀冷却，室温放置20 min后于490 nm测吸光度；以2.0 mL水按同样显色操作为空白对照，横坐标为多糖质量（μg），纵坐标为吸光度，得标准曲线：

2 结果与分析

2.1 外源NO对铁皮石斛类原球茎生长的影响

由图1可知，添加不同浓度的SNP对铁皮石斛类原球茎生长的影响不同，其干质量变化随着浓度的增加呈现出先上升后下降的趋势。T3、T4处理明显低于对照组；T5处理与对照组接近；T2处理效果最好，与各处理间差异显著，干质量含量比对照组高36.90%。

2.2 外源NO对铁皮石斛类原球茎叶绿素含量的影响

如表2所示，随着SNP浓度的升高，铁皮石斛类原球茎叶绿素含量呈现出先增加后降低的趋势。T3、T4处理均低于对照组；T5处理和对照组差异不显著；T2处理下各项指标明显高于其他处理，相比对照组叶绿素a含量提高了17.81%，叶绿素b含量提高了12.17%，总叶绿素含量提高了14.91%。

2.3 外源NO对铁皮石斛类原球茎多糖积累的影响

如图2所示，与对照组相比，随着SNP浓度的升高，铁皮石斛类原球茎多糖含量呈先升后降的趋势。T3处理效果最佳，且多糖含量显著高于对照组，高出14.49%；而T4处理抑制了多糖的产生，显著低于对照，仅为对照的92.21%；T5处理下的多糖含量与对照组差异不显著。

如图3所示，与对照组相比，T1、T2处理对铁皮石斛类原球茎多糖产量表现出促进作用，而T3、T4处理则表现出抑制作用；T5处理多糖产量接近对照组水平；T2处理下多糖产量最高，比对照组高出51.22%，且与各处理间差异显著。

3 结论与讨论

本试验研究了4种不同浓度的外源NO供体对铁皮石斛类原球茎的影响。试验结果表明，随着加入SNP浓度的增加，铁皮石斛类原球茎干质量、叶绿素、多糖产量均表现出先上升后下降的规律。说明低浓度的SNP（0.1、0.5 mmol/L）可以促进铁皮石斛类原球茎生长发育和多糖积累，但是高浓度的SNP（1、2 mmol/L）却有抑制作用。表现出的这种“低促高抑”效应可能是低浓度的NO可作为信号分子，对植物生长发育和次生代谢产物合成具有促进作用，而高浓度的NO本身对植物细胞有毒害作用。前人研究SNP 对绿豆下胚轴插条生根的试验表明，生根数与SNP剂量在一定浓度下呈正相关，但是浓度过大时表现出毒害效应[16]；而后刘建新等研究也得到类似的结论[10]。此外，樊洪泓研究外源NO对霍山石斛野生苗和试管苗的生理调节效应发现，SNP在10～50 μmol/L 浓度区间内有利于其生长和代谢，但是当SNP浓度高于75 μmol/LSNP即对霍山石斛试管苗产生明显的毒害作用[17]。与本试验得出的结论相似，不过本试验中T2处理（0.5 mmol/L）SNP效果最好，能显著地增加铁皮石斛类原球茎的干质量、叶绿素和多糖含量及产量。这种最佳作用浓度不同可能是因为针对不同的材料对NO的吸收和耐受能力不同。SNP的这种促进作用被NO专一性猝灭剂cPITO所抑制，表明的确是由SNP分解产生的NO所产生的功效，这与徐茂军等的研究结果[18]相似。

叶绿素是绿色植物中广泛存在的最主要色素，在光合作用中发挥着重要的生理功能，叶绿素含量的高低直接影响植株的光合强度，从而影响植株的生长[19]。本试验表明，低浓度SNP提高了叶绿素含量，同时还提高了干质量、多糖产量。樊洪泓等研究也发现，适宜浓度的SNP浓度提高了霍山石解的叶绿素含量、可溶性蛋白含量、苯丙氨酸解氨酶活性，进一步促进了生物碱的合成[17]。Leshem等发现，外源NO处理可促进豌豆叶片的增大，有利于光合作用[20]。邵瑞鑫等研究也发现，经过低浓度SNP处理可以明显改善小麦叶片的光合性能，从而促进地上部分干物质的积累[21]。因此，可能是因为NO促进了铁皮石斛类原球茎叶绿素的合成，从而增强了其光合作用，有利于其生长，同时也促成了葡萄糖、果糖、蔗糖等多糖合成的前体物质的增加，进而促进了干物质的积累和多糖的合成。

之前的研究表明，NO参与了植物次生代谢产物的合成调控。本试验也证明，适宜浓度的外源NO能够促进铁皮石斛类原球茎多糖产量的提高。张磊等在研究外源NO对人参愈伤组织次生代谢产物的影响时也发现，NO可以促进多糖和皂苷的积累[22]，与本研究结果一致。金青等试验表明，外源NO作用杂交石斛类原球茎，刺激类原球茎内源激素水平变化，从而诱导次生生物碱的合成与积累[23]。本试验中，NO作为信号分子参与了铁皮石斛类原球茎多糖的代谢，但是由于多糖的代谢途径尚不明确，因此关于NO对其作用机制还有待进一步研究。

参考文献：

[1]李 玲，邓晓兰，赵兴兵，等. 铁皮石斛化学成分及药理作用研究进展[J]. 肿瘤药学，2011，1（2）：90-94.

[2]华允芬. 铁皮石斛多糖成分研究[D]. 杭州：浙江大学，2005.

[3]李亚芳，张晓华，孙国明. 石斛中总生物碱和多糖的含量测定[J]. 中国药事，2002，16（7）：426-428.

[4]唐娅梅，张臣良，苏 兵，等. 铁皮石斛多倍化诱导与鉴定研究[J]. 北方园艺，2010（17）：147-149.

[5]高正华，杨兵勋，陈立钻. 铁皮石斛的研究进展[J]. 中国现代应用药学，2008，25（增刊2）：692-695.

[6]何铁光，杨丽涛，李杨瑞，等. 铁皮石解原球茎多糖DCPP1a-1对氧自由基和脂质过氧化的影[J]. 天然产物研究与开发，2007，19（3）：410-414.

[7]樊洪泓，李廷春，李正鹏，等. 强光胁迫下外源NO对霍山石斛叶绿素荧光和抗氧化系统的影响[J]. 园艺学报，2008，35（8）：1215-1220.

[8]金 青，蔡永萍，林 毅，等. NO对石斛类原球茎内源激素水平及生物碱积累的影响[J]. 核农学报，2010，24（6）：1291-1296.

[9]周永斌，殷 有，苏宝玲，等. 外源一氧化氮供体对几种植物种子的萌发和幼苗生长的影响[J]. 植物生理学报，2005，41（3）：316-318.

[10]刘建新，王 鑫，雷蕊霞. 外源一氧化氮供体SNP对黑麦草种子萌发和幼苗生长的影响[J]. 生态学杂志，2007，26（3）：393-398.

[11]Modolo L V，Cunha F Q，Braga M R，et al. Nitric oxide synthase-mediated phytoalexin accumulation in soybean cotyledons in response to the Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis elicitor[J]. Plant Physiology，2002，130（3）：1288-1297.

[12]徐茂军. NO调控植物细胞次生产物合成及其信号转导机制研究[D]. 杭州：浙江大学，2005.

[13]李合生. 现代植物生理学学习实验指南[M]. 北京：高等教育出版社，2007.

[14]叶余原. 超声法提取铁皮石斛多糖工艺的研究[J]. 中药材，2009，32（4）：617-620.

[15]丁宗博，姜 宏. 保健食品中水溶性多糖的测定[J]. 预防医学论坛，1999（4）：353.

[16]黄爱霞，余小平. 硝普钠（SNP）对绿豆下胚轴插条生根的影响[J]. 西北植物学报，2003，23（12）：2196-2199.

[17]樊洪泓. 霍山石斛的分子分类、NO生理调节作用研究及FPS基因的克隆[D]. 合肥：安徽农业大学，2008.

[18]徐茂军，董菊芳，张 刚. NO对金丝桃悬浮细胞生长及金丝桃素生物合成的促进作用研究[J]. 生物工程学报，2005，21（1）：66-70.

[19]张怀斌. 叶绿素的光学性质及其应用[D]. 济南：山东师范大学，2008.

[20]Leshem Y Y，Haramaty E. The chatacterization and contrasting effects of the nitric oxide free radical in vegetative stress and senescence of Pisum sativum Linn.foliage[J]. Journal of Plant Physiology，1996，148（3/4）：258-263.

[21]邵瑞鑫，上官周平. 外源NO调控小麦幼苗生长与生理的浓度效应[J]. 生态学报，2008，28（1）：302-309.

[22]张 磊，杨世海. 外源NO对人参愈伤组织次生代谢产物的影响[J]. 人参研究，2010，22（1）：5-9.

[23]金 青，蔡永萍，林 毅，等. NO对石斛类原球茎内源激素水平及生物碱积累的影响[J]. 核农学报，2010，24（6）：1291-1296. 徐昕彤，陈 宇，卫 笑，等. 基于AHP法的南京市节约型园林景观满意度评价[J]. 江苏农业科学，2016，44（4）：260-264.