一个融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析

王海娟戴雨珂苏森森王英潘渠

（1. 成都医学院病原生物学教研室，成都 610500；2. 成都医学院公共卫生系，成都 610500；3. 成都军区总医院肾内科，成都 610500）

一个融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析

王海娟1戴雨珂2苏森森1王英3潘渠1

（1. 成都医学院病原生物学教研室，成都 610500；2. 成都医学院公共卫生系，成都 610500；3. 成都军区总医院肾内科，成都 610500）

从融合魏斯氏菌（Weissella confusa QJ012）中发现一个隐蔽质粒（pQJ012），测序结果显示该质粒大小为1 489 bp，碱基G+C含量为42.8%。BLAST结果显示该质粒的核苷酸序列同pJY33和pKLCA的同源性分别为93%、92%。ORF1编码一个282个氨基酸残基的复制蛋白（Rep），其氨基酸序列与质粒pJY33和pKLCA的同源性分别为91%、85%。根据复制蛋白、dso和sso的序列特征，推定pQJ012的复制方式为滚环复制，是滚环复制pT181家族成员。质粒pQJ012可能构建为良好的表达载体。

融合魏斯氏菌；隐蔽质粒；序列分析；复制蛋白

魏斯氏菌（Weissella）属于乳酸菌（Lactic acid bacteria），近年来，魏斯氏菌在微生物学、医药学及发酵、工业、食品加工等方面的应用开始受到研究者的关注。魏斯氏菌作为益生菌的一员，对胃肠道健康有一定的促进作用［1］。魏斯氏菌具有β-葡糖苷酶活性［2］，较好的抗真菌性［3］，能促进乳杆菌（Lactobacillus）的生长［4］。魏斯氏菌产生的乳酸和各种胞外多糖，对食品的风味感官有一定的影响［5］。同时，相关魏斯氏菌新种的发现，证实其在食品的防腐方面也有着较大的应用潜能［6］。魏斯氏菌益生性质的广泛应用有待于其分子与基因水平更深层次的研究。

寻找新的质粒，构建转化率高的表达载体是促进魏斯氏菌基因工程发展的方法之一，也是魏斯氏菌走向实践应用的有效途径。2007年Park等［7］首次从韩国泡菜分离的食窦魏斯氏菌（W. cibaria）中鉴定出3个质粒，pKLCA、pKLCB和pKLCC。国内学者在对发酵辣白菜的研究中，从食窦魏斯氏菌中分离出2个质粒，其大小分别为3 000 bp和8 000 bp［8］。Kim等［9］从韩国泡菜分离得到的食窦魏斯氏菌（W. cibaria KLC140）中发现6种不同的质粒，其中最小的质粒长度为2 126 bp，命名为pKW2124，该质粒的复制方式为θ复制。将pKW2124与slpA和 gfp 的融合基因连接，导入载体pUC19，形成一个8.6 kb的表面展示载体pKWCSLGFP。随后，相关学者把pKW2124的复制起始点（ori）、核糖体结合位点（RBS）、复制蛋白（rep）基因插入克隆载体pUC19，形成载体pKUCm1。实验发现，pKUCm1宿主范围广泛，包括魏斯氏菌属（Weissella），乳球菌属（Lactococcus），明串珠菌属（Leuconostoc），乳杆菌属（Lactobacillus），同时，含有启动子的β-半乳糖苷酶基因被成功插入载体pKUCm1，形成可应用于蓝白斑筛选的质粒pKUGal［7］。目前，已发现的魏斯氏菌质粒还非常有限，而以上已被发现质粒中除pKW2124的复制方式被证实为θ复制外，其余质粒复制方式都不明确。新质粒的发现对魏斯氏菌分子生物学及遗传学的研究具有重要意义。

本研究从融合魏斯氏菌QJ012菌株中分离出一个隐蔽性质粒，并对该质粒进行测序和分析，旨在构建为良好的表达载体。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pUC57为广州艾基有限生物公司提供，T载体试剂盒、革兰阳性菌基因组提取试剂盒和PCR（Ex Taq）购自大连宝生物公司（TaKaRa）。质粒提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司，胶回收试剂盒购自Omega公司（Bio-Tek USA），限制性内切酶购自Thermo公司。培养条件：MRS培养基［10］37℃静置培养18-48 h。

1.2 方法

1.2.1 魏斯氏菌的分离鉴定 菌株QJ012样本来自湖南泡菜。将泡菜样品在MRS培养基上划线培养，挑取生长的单菌落进行革兰染色观察。魏斯氏菌应该为紫红色的短杆状细菌。培养筛选出的革兰阳性菌，用革兰阳性菌基因组提取试剂盒提取基因组。根据细菌16S rDNA基因的高度保守，利用细菌16S rDNA通用引物对（正义：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反义：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'），扩增QJ012菌株的16S rDNA基因。PCR扩增片段通过胶回收纯化，然后进行A-T克隆，最后送到成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.2.2 生化鉴定 过氧化氢酶试验采用传统方法进行。葡萄糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖、麦芽糖的发酵产酸试验使用细菌微量生化管进行，培养方式为37℃静置培养［11］。

1.2.3 质粒提取与测序 离心收集融合魏斯氏菌QJ012菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒pQJ012，胶回收试剂盒分离纯化质粒条带。将分离纯化得到的质粒委托广州艾基生物有限公司进行测序，方法为物理破碎后导入载体pUC57，然后测序。

1.2.4 酶切鉴定 测序后通过分析pQJ012具有的酶切位点，使用HindⅢ和Nhe I 对质粒提取液进行双酶切，通过分析酶切前后条带大小，鉴定其能否被相应限制性内切酶切开。

1.2.5 质粒相似性鉴定及序列注释 利用序列比对工具BLAST，在GenBank数据库中比对融合魏斯氏菌质粒pQJ012的测序结果，检索该质粒与已知魏斯氏菌质粒的同源性。利用NCBI网站上的ORF Finder（Open reading frame finder）寻找该质粒可能存在的开放阅读框（ORF）。利用DNAMAN（V6）软件标注该质粒的重要酶切位点。

1.2.6 复制方式推定 通过分析质粒pQJ012的Rep以及dso和sso保守序列，推导pQJ012复制方式所属家族及其可能的复制方式。

2 结果

2.1 魏斯氏菌的分离鉴定

从样本中分离出一株魏斯氏菌，在MRS平板培养基上，魏斯氏菌形成透明的小菌落，呈微隆起圆状轮廓；革兰氏染色后镜检发现该菌呈革兰氏阳性，短杆状，将其命名为QJ012。QJ012菌株的16S rDNA基因扩增片段长1 631 bp，序列比对结果表明，融合魏斯氏菌（W.confusa Inje LM S-338）的16S rDNA序列（GenBank：DQ321751.1）是与扩增片段最相似的序列，相似性为99.9%，1 569 bp中有2个碱基不同；其次是魏斯氏菌（Weissella sp. MMZ50B，GenBank：EU157913.1），相似性为99.7%，1 546 bp中有5个碱基不同。QJ012菌株的16S rDNA基因同与其最相似的融合魏斯氏菌的16S rDNA基因差异仅为0.01 %，可判断QJ012菌株为融合魏斯氏菌。

2.2 生化试验验证

融合魏斯氏菌QJ012的生化试验结果为不产生过氧化氢酶，不能利用L-阿拉伯糖，发酵葡萄糖、纤维二糖、半乳糖和麦芽糖均产酸，符合魏斯氏菌属和融合魏斯氏菌种的生化特征。生化试验结果符合分子鉴定的结论。

2.3 质粒提取与序列测定

融合魏斯氏菌QJ012质粒提取液电泳结果（图1）显示该提取液有2个条带，分别为1.5 kb和14.5 kb，提示QJ012可能携带两个质粒。将较小的条带代表的质粒命名为pQJ012，分离纯化该质粒，委托广州艾基生物有限公司进行测序。测序后发现该质粒大小为1 489 bp，测序结果提交GenBank，登录号为：KR973434。

2.4 酶切鉴定

通过DNAMAN软件对pQJ012序列的酶切位点分析显示其能被HindⅢ和Nhe I切开。两个酶切位点相距347个碱基，双酶切后，质粒将被切为347 bp和1 142 bp两个线性片段。融合魏斯氏菌质粒提取液经双酶切后电泳结果（图1）显示有0.3 kb、1.1 kb、1.2 kb、2 kb和13 kb共5条条带，其中0.3 kb与1.1 kb条带应为pQJ012被切开后产生的条带，1.2 kb、2 kb和13 kb条带应为14.5 kb条带所代表质粒被切开后产生的条带。

图1 融合魏斯氏菌质粒pQJ012酶切鉴定电泳图

2.5 质粒相似性鉴定及序列注释

质粒pQJ012的G+C含量为42.8%，BLAST比对结果显示，该质粒的核苷酸序列与食窦魏斯氏菌中已被发现的质粒pJY33（2 365 bp）、pKLCA（1 490 bp）最为相似，与pJY33（GenBank number：KF879106.1）的相似性为93%，1 454 bp中相似序列长度为1 354 bp；与pKLCA（GenBank number：AY188776.1）的相似性为92%，1 498 bp中相似序列长度为1 364 bp。目前，pJY33与pKLCA在PubMed尚无文献可供查阅。通过ORF搜索，pQJ012有5个ORF，ORF1编码一个282个氨基酸残基的蛋白，从593 bp到1 441 bp，应为该质粒的复制蛋白（Rep）（图2）；其余ORF在GenBank没有与之相匹配的蛋白。该Rep的氨基酸序列与pJY33和pKLCA的Rep氨基酸序列同源性分别为91%和85%。 该质粒没有编码影响菌株表型的蛋白，应归为隐蔽质粒。

图2 质粒pQJ012的物理图谱

2.6 复制方式推定

滚环复制的质粒必须携带dso和sso位点，并编码相关复制蛋白，根据dso和复制蛋白的不同，滚环复制的质粒至少被分为7大家族：pT181、pC194/pUB110、pE194/pLS1、pSN2、pGA1、pG13和pTX14［12］。pT181家族的复制蛋白的保守结构域是pfam02486，dso位点有三项特征：复制蛋白切开位点nic区的保守序列为TAATAG［13］；围绕nic区有3个反向重复序列［14］；dso位点位于复制蛋白编码区的N端。pT181家族的sso位点为ssoA，其保守序列是TAGCGA/T［13］。经过序列分析，pQJ012的复制蛋白具有保守结构域pfam02486；其dso位点具有pT181家族的三项特征（图3-A，图4）。pQJ012的 sso位点吻合ssoA的特征（图3-B）。综上，我们推定pQJ012的复制方式为滚环复制，属于pT181家族。

图3 质粒pQJ012 dso（A）和pQJ012 ssoA（B）序列比对图

图4 质粒pQJ012复制起始点示意图

3 讨论

魏斯氏菌属于益生菌，能产生β-葡糖苷酶、胞外多糖，具有食品防腐性能等优势，在医药与食品加工方面具有极大的开发潜力和商业价值。魏斯氏菌质粒的研究是在分子基因水平改造魏斯氏菌的基础，新质粒的发现，对于微生物的遗传学研究和构建具有自主知识产权的表达载体都具有重要意义。目前，魏斯氏菌质粒的研究还非常有限，魏斯氏菌中已被发现并对其序列进行了分析研究的质粒有pKLCA、pKLCB、pKLCC［7］和pKW2124［9］。以上被发现的质粒中，只有pKW2124的复制方式已被验证为θ复制，同时pKW2124已被成功构建为表达载体［9］，而且以上已被分析的魏斯氏菌中的质粒均分离自食窦魏斯氏菌。本研究中pQJ012为融合魏斯氏菌中首次被分离报道的质粒，pQJ012同食窦魏斯氏菌中已发现的质粒pJY33（2 365 bp）和pKLCA（1 490 bp）最相似。这两个质粒在GenBank中有供查询的序列，但在PubMed尚无文献可供直接查阅。

分析pQJ012、pJY33和pKLCA的基本元件，即复制起点和复制蛋白，发现他们都属于滚环复制pT181家族。pQJ012、pJY33与pKLCA的质粒复制双链启动位点dso都符合滚环复制pT181家族的特征，nic区都含有保守序列TAATAG，围绕nic区都有3个反向重复序列。只是3个质粒的反向重复序列的碱基序列虽然相同，但间距有所不同。3个质粒的质粒复制单链启动位点sso都是ssoA。3个质粒的推定复制蛋白（Rep）的氨基酸序列同源性很高，都有滚环复制蛋白保守结构域pfam02486。

4 结论

本研究首次从融合魏斯氏菌中发现一个隐蔽质粒pQJ012，其核苷酸序列同食窦魏斯氏菌中的pJY33和pKLCA的同源性分别为93%和92%。ORF1编码复制蛋白（Rep），该复制蛋白氨基酸序列与质粒pJY33和pKLCA的同源性分别为91%和85%。推断pQJ012的复制方式为滚环复制，属于滚环复制pT181家族成员，质粒pQJ012可能构建为良好的表达载体。

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（责任编辑 李楠）

Complete DNA Sequence Analysis of a Cryptic Plasmid Isolated from Weissella confusa

WANG Hai-juan1DAI Yu-ke2SU Sen-sen1WANG Ying3PAN Qu1
（1. Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；2. School of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；3. Department of Kidney Disease，General Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu 610500）

A cryptic plasmid isolated from Weissella confusa QJ012，designated as pQJ012，was sequenced and characterized，and it was a 1489 bp circular molecule with a 42.8% G+C content. The result of BLAST showed that nucleotide sequence of pQJ012 was in homology with pJY33（93%）and pKLCA（92%）. ORF1 encoded a 282 amino acid residue Rep protein that was 91% identical to pJY33 and 85% identical to pKLCA in homology. Sequence analysis indicated that plasmid pQJ012 belonged to pT181 family of rolling-circle replication（RCR）. The pQJ012 may be constructed as a promising expression vector.

Weissella confuse；cryptic plasmid；sequence analysis；replication protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.029

2015-08-13

国家自然科学基金项目（31170007），四川省教育厅科技基金重点项目（14ZA0219），成都医学院病原生物学学科建设项目（CYXK2012005）

王海娟，女，研究方向：病原生物与感染性疾病研究；E-mail：934147264@qq.com

潘渠，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：病原生物与感染性疾病研究，E-mail：ppqlove@126.com；王英，E-mail：renshicu123456@163.com