微载体浓度与细胞接种密度对 ST 细胞生长的影响

陈以衡 陶姝宇 刘旭平 谭文松

（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

微载体浓度与细胞接种密度对 ST 细胞生长的影响

陈以衡 陶姝宇 刘旭平 谭文松

（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

选择合适的微载体浓度、细胞接种密度以提高微载体利用率，优化微载体培养体系猪睾丸细胞（Swine testicle cells）的贴附生长与维持。使用DMEM补加10%血清、LSM（Low serum medium）两种培养基考察微载体浓度、细胞接种密度对细胞生长维持的影响，进而比较ST细胞在不同条件下对Cytodex 1微载体的利用率。结果显示，使用LSM在T150方瓶中连续传代培养30 d，平均比生长速率为0.626 d-1，是DMEM补加10%FBS培养基的1.15倍。选择10×105cells/mL细胞接种3 g/L Cytodex 1搅拌瓶体系，最大细胞密度为38.3×105cells/mL，微载体利用率上升到58.8%。在灌注培养体系中培养ST细胞15 d，最终细胞密度达到36.6×105cells/mL，扩增了13.6倍。微载体悬浮培养的使用一方面有利于ST细胞的贴附与生长，实现高密度生长，另一方面增加了微载体的使用成本，选择合适的微载体浓度、细胞接种密度，能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞的最优生长。

微载体；ST细胞；猪瘟病毒；细胞密度

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、发热、高度接触性的严重传染病［1］。由于猪瘟流行爆发给养猪业、国际贸易和食品安全带来的严重危害，世界动物卫生组织（OIE，2002）将猪瘟列为法定必须上报的动物传染病之一，我国出台的《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》中也将其列为优先防治的五种一类动物疫病之一［2，3］。目前国内贯彻预防为主的方针，免疫接种猪群猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）应对全国各个地区猪瘟的不间断散发流行［4］。

猪睾丸细胞系（ST）与猪同源，是猪瘟病毒最为易感的细胞系之一，能稳定猪瘟疫苗生产工艺并有效提高病毒滴度，在猪瘟细胞源疫苗研究中被广泛使用［5，6］。目前利用ST细胞生产猪瘟疫苗大多采用传统的滚瓶贴壁培养工艺，操作过程繁琐，疫苗产量有限［7］。微载体悬浮培养体系具有比表面积大、易检测、易控制等优点，能为细胞生长及病毒增殖提供相对优良、恒定的培养环境，在细胞源疫苗生产中已得到广泛应用，如狂犬病疫苗、流感疫苗等［8-11］。建立稳定高效的ST细胞微载体培养体系，能克服滚瓶培养工艺的缺陷，是大规模生产细胞源猪瘟疫苗的重要基础。

许多研究表明，细胞的生长与细胞接种密度和微载体浓度密切相关［12-19］。一般细胞接种密度越高，最高活细胞密度（Viable cell density，VCD）也越高，但易引起营养物的不足与代谢副产物累积造成难以维持高细胞密度，而较低的接种密度可能使初始细胞量与微载体的比例过低，影响初期细胞与微载体的接触及黏附，微载体空球现象增加；相应地，提高微载体浓度可以增加贴壁面积，但同时微载体之间碰撞的几率增加，造成细胞损伤机会也增多，细胞扩增倍数未能按理想状况成比例增加，此时，过高浓度的微载体会增加成本。因此，在ST细胞大规模培养过程中，选择合适的微载体浓度与细胞接种密度提高微载体利用率，对细胞增殖、维持和后期接种病毒的扩增效率尤为重要。

本研究在本实验室前期自行设计开发的ST细胞低血清贴壁培养基与DMEM+10%FBS两种培养基基础上，考察微载体浓度及细胞接种密度对细胞生长代谢的影响，旨在提高微载体利用率，并在灌注培养体系初步实现ST细胞的培养。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用贴壁依赖型猪睾丸传代细胞系ST细胞株（Swine testis cells）购自中国兽医药品监察所。贴壁型ST细胞培养用培养基：DMEM（Gibco公司）补加3.7 g/L碳酸氢钠（Amresco公司），添加10%胎牛血清FBS（Fatal Bovine Serum，南京Wisent公司）。

贴壁型ST细胞培养用低血清培养基：本实验室自行设计开发，包括葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐和金属离子等成分，补加1%FBS。

1.2 方法

1.2.1 ST细胞培养方法

1.2.1.1 ST细胞方瓶培养 待贴壁型ST细胞生长至铺满方瓶（TPP公司）底部约80%-90%时，吸去培养基，PBS漂洗2-3次，加入0.25%（W/V）胰酶（Sigma公司）-0.05%（W/V）EDTA（Sigma 公司）消化液置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱孵育，当细胞收缩变圆，轻摇方瓶至脱落时，稀释接种，接种密度为2×105-3×105cells/mL。

1.2.1.2 ST细胞搅拌瓶贴壁培养 所用微载体为Cytodex 1（GE Healthcare）。称量所需微载体于125 mL搅拌瓶（Corning 公司），PBS洗涤3次至微载体水化、膨胀完全后去除多余PBS，121℃湿热灭菌30 min待用。将消化后的细胞种子液接种至装有微载体的无菌搅拌瓶，培养液体积为100 mL，放置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中搅拌平台（INTEGRA）培养，搅拌转速为50 r/min，每24 h取样进行细胞计数与代谢分析。

1.2.1.3 ST细胞灌注培养 采用自制灌注培养设备进行细胞灌注培养。如图1所示，该装置主要由灌注培养腔（120 mL）、培养基存贮瓶（120 mL）、灌注循环系统构成。使用3 g FibraCel disk 微载体（NBS公司）。将消化后的细胞种子液转移到经高压灭菌的灌注培养装置中，接种密度2×105cells/mL于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行灌注培养，控制培养基流速为2.5 mL/min，每24 h取样进行代谢分析，每3 d进行存贮瓶全换液，培养15 d后取出微载体进行细胞密度检测。

图1 灌注培养体系装置与示意图

1.2.2 有关操作参数的实验方法

1.2.2.1 微载体浓度对ST细胞生长代谢的影响 将5×105cells/mL ST细胞接种至125 mL搅拌瓶，搅拌瓶中微载体用量分别为1、3、5和7 g/L。

1.2.2.2 细胞接种密度对ST细胞生长代谢的影响 接种微载体用量为3 g/L的125 mL搅拌瓶，接种密度分别为1×105、3×105、5×105和10×105cells/mL。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 细胞密度与增殖参数测定 微载体上贴附生长的细胞以0.1%低渗结晶（贝基生物科技有限公司）-0.1 mol/L柠檬酸（Sigma公司）染液染色，台式振荡器37oC振荡过夜，PBS稀释至适当浓度后用血球计数板计数紫色细胞核。

1.2.3.2 DNA含量检测 取10片disk于EP管中，PBS漂洗后，经1 mL 0.5 g/L木瓜蛋白酶（Sigma公司）恒温水浴锅60℃孵育24 h，-20℃冻存待用。事先配制100 ng/mL Hoechst 33258（Invitrogen公司）TNE溶液，并提取2.68×106cells/mL细胞悬液所含DNA，按Hoechst荧光定量法在350 nm波长下使用核酸蛋白荧光分析仪（Bio-Rad）测量荧光强度并绘制DNA标准曲线，取5 μL样品DNA进行含量测定并换算成细胞密度。

1.2.3.3 搅拌瓶中细胞培养的代谢物浓度测定 葡萄糖浓度测定采用葡萄糖试剂盒（上海科欣生物试剂公司），操作按使用说明书进行。乳酸浓度测定采用乳酸测定试剂盒（南京建成生物工程公司），操作按使用说明书进行。氨浓度采用尿素氮试剂盒（上海申索试剂有限公司）测定，操作按使用说明书进行。

1.2.3.4 灌注装置中细胞培养代谢物浓度测定 培养过程中葡萄糖、乳酸、氨的浓度和pH值均采用全自动生化分析仪BioProfile 400 Analyzer测定。

1.2.4 计算方法

1.2.4.1 细胞比生长速率的计算 比生长速率μ通过以下公式计算：

式中，XV：活细胞密度（106cells/mL），t：培养时间（d）。

1.2.4.2 葡萄糖比消耗速率、乳酸比生产速率的计算 葡萄糖的比消耗速率和乳酸的比生成速率计算方法相似，以葡萄糖比消耗速率为例，通过以下公式计算：

式中，qgluc：葡萄糖的比消耗速率（mmol/109cells/ day），代表细胞消耗葡萄糖的速率；P：葡萄糖的浓度（mmol/L）；IVC：微载体上贴附生长的总细胞数目对时间的积分（109cells·day）。

1.2.4.3 乳酸对葡萄糖的转化率的计算 乳酸对葡萄糖转化率Ylac/gluc（mmol/mmol）通过下式计算。

2 结果

2.1 两种培养基中ST细胞增殖能力比较

分别使用DMEM和LSM两种培养基在T150方瓶中连续传代培养ST细胞30 d，比较两者ST细胞比生长速率。ST细胞在DMEM培养基中平均比生长速率为0.545 d-1（图3-A）；在LSM培养基中，ST细胞平均比生长速率为0.626 d-1（图3-B）。相比DMEM培养基，ST细胞在LSM中以更高的比生长速率连续稳定传代。

2.2 微载体浓度对细胞生长代谢的影响

图3-A是使用DMEM培养基搅拌瓶培养体系，不同微载体浓度条件下ST细胞密度随时间的变化。固定细胞接种密度为5.0×105cells/mL时，4个条件下的ST细胞密度在接种后24 h内细胞密度变化基本一致，且均在第3天达到最大，分别为16.6×105、14.6×105、15.1×105和9.5×105cells/mL。随着微载体浓度的上升，最大细胞密度不升反降，在微载体浓度为7 g/L条件下，细胞生长缓慢仅扩增0.9倍。从ST细胞增殖情况较好5 g/L微载体浓度的倒置显微镜明场（图3-C）可以看出，使用DMEM培养基在培养过程中始终存在微载体未贴满的现象。

图2 ST细胞T150方瓶连续传代曲线

图3 不同微载体浓度条件下ST细胞生长曲线与贴附情况（40×）

对比图3-B使用LSM培养基搅拌瓶体系培养ST细胞，4组不同微载体浓度实验组ST细胞密度分别在第4天、第7天、第9天、第10天时达到最大，为 23.2×105、29.3×105、39.6×105和 47.4×105cells/mL，均显著高于相同条件下DMEM培养基对应实验组的最大细胞密度。1 g/L微载体用量的实验组在第4天细胞密度达到最大后，存在一个维持了5 d的平台期。并且从该条件下ST细胞显微镜明场（图3-D）也可以看出，培养过程中，微载体几乎始终处于满球的状态。

从细胞培养中葡萄糖、乳酸和氨的浓度变化来看，使用LSM葡萄糖消耗情况并未有显著差别，4个微载体浓度条件下第13天葡萄糖浓度分别为5.60、5.99、3.23和1.88 mmol/L（图4-A）。氨均未大量生成，培养结束时分别为3.77、4.56、3.81和3.23 mmol/L（图4-C）。而副产物乳酸在培养过程中呈现持续累积的情况，培养结束时分别为17.2、20.7、13.4和11.3 mmol/L（图4-B）。从图4-D可以看出，微载体浓度为7 g/L的条件下乳酸对葡萄糖的得率最低，3 g/L条件下该得率最高。

根据单个ST细胞贴壁面积约为200 μm2，每克Cytodex 1能提供的生长表面积为4 400 cm2。计算不同浓度微载体理论最高ST细胞密度，并与实际值相比得到微载体的利用率进行比较（表1）发现，3 g/L的微载体用量既能提供充足的贴壁面积，又能保持较高的微载体利用率，所以使用该浓度进一步研究细胞接种密度对细胞生长的影响。

图4 LSM不同微载体浓度对ST细胞代谢的影响

表 1 LSM不同微载体浓度条件下的微载体利用率

2.3 细胞接种密度对细胞生长代谢的影响

图5-A是使用DMEM培养基搅拌瓶培养体系，不同ST细胞接种密度条件下细胞密度随时间的变化。固定微载体浓度为3 g/L时，不同细胞接种密度条件下，4个实验组分别在第2天、第3天、第5天和第6天达到最大细胞密度，分别为17.4×105、16.2×105、15.9×105和14.4×105cells/mL，并没有显著差异。对比图5-B，使用LSM搅拌瓶培养体系考察细胞接种密度对细胞生长的影响，当微载体浓度为3 g/L，不同细胞接种密度分别出现在第5天，第6天、第7天、第8天达到最大细胞密度，为37.9×105、29.4×105、29.3×105和 27.1×105cells/ mL，与初始接种密度相比，分别增殖了2.88倍、4.86倍、8.80倍 和26.10倍。IVCC分别为38.1×109、26.7×109、25.2×109和20.5×109cells.d/L。微载体利用率分别为57.4%、44.5%、44.4%和41.0%。

图5 不同细胞接种密度条件下ST细胞贴壁生长曲线

图6 LSM不同ST细胞接种密度条件下对细胞代谢的影响

从细胞培养过程中葡萄糖、乳酸和氨的浓度变化来看，使用LSM葡萄糖消耗趋势并未有显著差别，四组细胞接种密度条件下，葡萄糖浓度在培养结束时分别为5.63、5.99、3.23和1.88 mmol/L（图6-A）。氨均未大量生成，培养结束时分别为2.99、4.02、3.67和2.93 mmol/L（图6-C）。而副产物乳酸在培养过程中持续累积，培养结束时分别为13.8、18.0、20.7和20.9 mmol/L（图6-B）。从图6-D可以看出，10×105cells/mL时，乳酸对葡萄糖的得率最低；而当细胞接种密度为3×105cells/mL时，乳酸对葡萄糖的得率最高。

2.4 灌注体系培养过程中ST细胞生长与代谢

如图7所示，使用LSM进行ST细胞灌注体系培养，在第4天（第一次换液）后，葡萄糖浓度在28.25-35.35 mmol/L的范围内波动，培养结束时浓度为25.52 mmol/L，代谢副产物氨的浓度在2.56-3.72mmol/L的范围内稳定波动，培养结束时浓度为3.02 mmol/L。但代谢副产物乳酸的浓度呈现持续上升的现象，培养结束时乳酸浓度为25.00 mmol/L，对应的pH值也呈现持续下降的现象，培养结束时pH值6.87。如图8所示，以2、4、6、9、12和15 μL 26.8×105cells/mL细胞悬液DNA吸光值做标准曲线。灌注培养15 d ST细胞终密度为36.6×105cells/mL，扩增了13.6倍，经过计算得到此时微载体利用率为24.4%。

图7 LSM灌注培养体系ST细胞代谢

3 讨论

从上述研究中我们发现，在1-7 g/L微载体用量范围内，使用DMEM培养基在搅拌瓶培养体系中接种相同密度的ST细胞，随着微载体浓度的上升，最大细胞密度不升反降。在初始24 h内细胞密度变化基本一致，说明并不是细胞贴附阶段贴附率的差异导致高微载体浓度低细胞密度现象的发生，结合倒置显微镜下5 g/L微载体浓度细胞贴附情况，可以得到即使在提供了充足的微载体贴壁面积条件下，ST细胞仍不能以较高效率利用提供的贴附面积。这很有可能是在平均每个微载体接种细胞数较少的情况下，DMEM培养基不能较好地支持ST细胞在微载体上良好的延伸和增殖导致的。此时，1 g/L与5 g/L微载体浓度下能得到相对较高的细胞密度，相对1 g/L微载体75.5%的利用率，5 g/L微载体利用率仅为13.7%，过多微载体的使用并没有显著增加细胞密度反而大大增加了成本。何锡忠等［20］对PK-15细胞搅拌瓶培养的研究同样发现，微载体浓度与PK-15细胞密度仅有一定程度的相关性，高浓度微载体的表面积并没有被充分利用。

使用LSM培养基，搅拌瓶体系中最大细胞密度随着微载体浓度的上升而上升，且出现时间也随之推迟。1 g/L微载体用量的实验组在达到最大细胞密度后存在为期5 d的平台期，结合该条件下倒置显微镜可以看出是贴附面积有限导致的。此时，3 g/L是较为理想的浓度，既能提供充足的贴壁面积，又能保持44.4%的微载体利用率，最大细胞密度可以达到29.3×105cells/mL。在此基础上进一步考察优化细胞接种密度，提高细胞接种密度可以增加最大细胞密度，选择10×105cells/mL接种，最大细胞密度达到37.9×105cells/mL，扩增了2.88倍，微载体利用率达到57.4%，并且存在一个维持5 d的平台期，代谢副产物积累对培养环境造成压力较小，这对于我们最终生产猪瘟病毒的目的是有利的。但需要注意的是，在DMEM培养基中，高密度接种虽然减少了达到最大细胞密度的时间，但最大细胞密度并没有显著增加，并且也不能较好维持细胞密度，此时不能盲目增加接种密度。有很多研究得到细胞与微载体的最优接种比［16，20］，如PK-15细胞以10-15 cells/MC接种时生长状态最优。我们的结论进一步证明微载体的用量与接种密度仍需要根据细胞在不同培养基中增殖延伸能力的差异设置更为合理的范围。

最终，使用LSM培养基在灌注培养体系中培养ST细胞，细胞密度达到36.6×105cells/mL，扩增了14.6倍，FibraCel disk微载体利用率为24.4%，与使用Cytodex 1搅拌瓶培养体系有一定差距，为期3 d的换液间隔导致大量乳酸的累积可能是其原因。后续实验拟减少换液时间，提高细胞接种密度，保持培养过程中低浓度乳酸含量，以期在灌注培养体系得到高细胞密度并提高微载体利用率。

图8 灌注系统DNA含量Hoechst检测

4 结论

本研究使用DMEM补加10%FBS与LSM两种培养基，通过考察微载体浓度与细胞接种密度对搅拌瓶培养体系中ST细胞增殖维持能力的影响，提高了微载体利用率，优化了细胞生长。进一步在灌注培养体系中初步实现了ST细胞片状微载体培养。

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（责任编辑 李楠）

The Effects of Microcarrier Concentration and Cell Density on the Growth of Swine Testicle Cells

CHEN Yi-heng TAO Shu-yu LIU Xu-ping TAN Wen-song
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

This study is to select the suitable microcarrier concentration and cell seeding density for enhancing the utilization of microcarrier，and optimize the adhered growth and m aintenance of ST（swine Testicle）cells. The effects of microcarrier concentration and seeding density on cell growth and maintenance were investigated using 2 different mediums：DMEM supplemented 10% serum or low serum medium（LSM）. Further，the utilizations of Cytodex 1 microcarrier by ST cells under different conditions were compared. Results were as below：continuous culture of ST cells in T150 flask using LSM lasted for 30 days，and the average specific growth rate was 0.626 d-1，which was 1.15 times of that using DMEM supplemented with 10% FBS. The maximum cell density was 38.3×10 cells/mL and the utilization was up to 58.8% when microcarrier concentration was 3 g/L Cytodex 1 in mixing bottle and seeding density was 10×105cells/mL. Furthermore，when cultured in perfusion system for 15 days，the final ST cell density reached 36.6×105cells/mL，which amplified 14.6 times. Conclusively，the uses of serum and microcarrier are favorable for ST cell adhesion and growth to achieve high cell density，but also this increases the cost of introducing microcarrier. Maximum utilization of microcarrier and nutrients in the medium，and the optimal growth and maintenance could be achieved through selecting suitable microcarrier concentration and seeding density. The results in this work provide guidance for further industrial-scale microcarrier culture system producing CSFV vaccine.

microcarrier；ST cells；classical swine fever virus；cell density

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.033

2015-10-19

国家自然科学基金项目（21206040，21406066），国家“863”计划项目（2012AA02A303），国家重大专项（2013ZX10004003-003-003），中央高校基本科研业务费（WF1214035）

陈以衡，男，硕士研究生，研究方向：动物细胞的大规模培养；E-mail：yihengchen91@126.com

刘旭平，男，博士，讲师，研究方向：动物细胞的大规模培养，E-mail：xupingliu@ecust.edu.cn；谭文松，男，博士，教授，研究方向：动物细胞培养与组织工程，E-mail：wstan@ecust.edu.cn