三疣梭子蟹nm23基因克隆及在卵巢发育中的表达分析

徐晴 朱冬发 谢熙 邱锡尔 沈锡权

（宁波大学海洋学院，宁波 315211）

三疣梭子蟹nm23基因克隆及在卵巢发育中的表达分析

徐晴 朱冬发 谢熙 邱锡尔 沈锡权

（宁波大学海洋学院，宁波 315211）

Nm23基因编码的核苷二磷酸激酶（NDPK）参与调控生物体的多项生理功能，包括生长、发育、分化和肿瘤转移等。根据三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）转录组数据库中的nm23同源序列，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）首次克隆获得了三疣梭子蟹nm23基因的全长cDNA序列（GenBank登录号：KP027331）。该序列全长777 bp，编码一个151个氨基酸的蛋白，该蛋白包含一个典型的核苷二磷酸激酶（NDPK）区域，具有NDPK活性位点和多肽结合位点。推导的氨基酸序列与已知甲壳动物的nm23一致性达到90%以上，与脊椎动物第一类nm23的一致性也达到70%以上。系统进化树分析发现第一类nm23与第二类nm23分别聚为一支，甲壳动物nm23属于第一类，且与nm23-1和nm23-2亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术分析了三疣梭子蟹nm23的组织差异表达及其在卵巢发育过程中的表达水平变化，结果表明nm23在三疣梭子蟹各组织内均有表达，其表达水平在眼柄、肌肉和Y器中最高，卵巢和肝胰腺次之。在三疣梭子蟹卵巢发育过程中，卵巢中nm23的表达水平在Ⅰ期最高，之后随着卵巢发育的进行，其表达水平逐渐下降，并在成熟期降至最低，这表明nm23可能参与调控三疣梭子蟹的卵巢发育。

三疣梭子蟹；nm23；基因克隆；卵巢发育；基因表达

Nm23基因编码的核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDPK，EC 2.7.4.6）可以催化核苷三磷酸发生磷基转移从而生成相应的核苷二磷酸（NDP）［1］。研究表明，NDPK不仅可以作为看家基因维持生物体内核苷酸平衡，还参与调节细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和细胞信息传递等多种生物学功能［2-4］。Nm23基因最早于1988年由美国国立癌症研究所的Steeg等［5］应用差示杂交（differential hybridization）等技术从小鼠黑色毒瘤K-1735细胞株中分离获得，并证实其与肿瘤转移抑制有关。与此同时，果蝇（Drosophila melanogaste）中也发现其同源基因awd（abnormal wing discs）参与调控昆虫的正常发育［6，7］。之后，nm23被发现广泛存在于从单细胞生物到哺乳动物的多个物种中［1，8-13］，是一个具有高度同源性的保守基因家族。

大多数多细胞生物中都发现了nm23亚型的存在，其亚型的数量和多样性似乎与生物体结构的复杂性正相关［14］。例如，单细胞生物大肠杆菌（Escherichia coli）［15］和啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［16］分别只有一个nm23亚型，而最原始的多细胞生物盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）中则存在两种nm23亚型［17］。人类的nm23有10种亚型，根据蛋白序列结构组成和磷酸转移酶活性又将其分为两大类［18，19］。第一类包括nm23-H1至H4，它们的序列组成较为相似，均包含一个高度保守的NDPK活性位点结构域，具有传统的NDPK活性。第一类基因广泛表达于人体的各个组织，其中nm23-H1和nm23-H2一致性最高（88%），且能形成同源或异源六聚体［1］。第二类nm23包括H5至H10，与第一类基因相比，它们序列的差异较大，且拥有延伸的N末端和C末端。NDPK活性位点结构域在第二类基因中并不保守，仅在nm23-H6中发现了NDPK活性［20］。第二类基因一般具有组织表达的特异性，nm23-H5、H6和H8均主要在人类精巢中表达［20-22］。

甲壳动物中有关nm23的报道较少，在已知nm23物种中均只发现一个亚型。该亚型属于第一类nm23，拥有NDPK结构域，被认为参与甲壳动物的应激和免疫反应［23，24］、配子发生［25］和性腺发育［26］。开展甲壳动物nm23及其功能的研究，将有助于加深人们对NDPK及其进化过程的理解。因此，本研究利用三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）转录组文库，首次克隆获得了三疣梭子蟹的nm23基因，并运用实时荧光定量PCR（qPCR）分析其组织分布特性以及在卵巢发育过程的表达水平变化，以探究nm23在三疣梭子蟹卵巢发育过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 2013年10月-2014年4月，分多次从宁波市镇海区水产品市场购买处于第一次卵巢发育的三疣梭子蟹（体重90-335 g），根据卵巢外观特征及性腺指数将三疣梭子蟹第一次卵巢发育划分为Ⅰ-Ⅵ等6个时期［27］，采集Ⅰ-Ⅴ期蟹（每期4只）的卵巢用于检测nm23的相对表达水平。另采集蜕皮间期蟹（雌、雄各4只）的表皮、精巢、卵巢、肝胰腺、大颚器、肌肉、眼柄、Y器、心脏、脑和胸神经节用于组织表达差异性分析；组织解剖于冰上进行，并将组织存放在RNA保存液中，-20℃保存待用。

1.1.2 主要试剂 RNA保存液、Trizol 试剂盒及DNA回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；DNase I、PrimeScript RT reagent Kit及 SYBR®Premix Ex TaqTMII kit等 试 剂 盒 购 自TaKaRa公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit购 自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及反转录 将上述组织样品按照Trizol 试剂盒说明书进行总RNA提取。总RNA经DNase I去除基因组DNA后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用超微量分光光度计Nanodrop 2000（Thermo scientific，USA）进行纯度分析。用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将总RNA进行反转录得到cDNA。

1.2.2 三疣梭子蟹nm23基因的克隆 从三疣梭子蟹转录组数据库中检索获得一段nm23基因的同源序列，设计引物NM23-F和NM23-R（表1），以卵巢组织的cDNA为模板，进行PCR验证。根据该核心序列设计基因特异性引物（表1），利用RACE技术分别对三疣梭子蟹nm23基因的3'和5'端进行巢式PCR扩增。3' RACE-cDNA将接头引物AP替换上述试剂盒中的Oligo dT primer和Random 6 mers后用相同的方法进行制备，5' RACE-cDNA按照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒（clontech）进行合成（表1）。以上PCR均在25 μL体系下进行，反应条件如下：94℃预变性3 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 30 s，33个循环；72℃延伸10 min。所有PCR产物经琼脂糖电泳后，用DNA回收试剂盒（上海生工，上海）进行回收和连接，并转化至E. coli DH5α感受态细胞进行培养，之后选取阳性克隆菌落交由上海生工生物工程有限公司进行测序。

表1 PCR引物序列

1.2.3 序列分析 利用Vector NTI 10.0测序软件将核心序列和3' RACE、5' RACE的测序结果进行拼接，获得三疣梭子蟹nm23基因的cDNA全长。利用NCBI ORF Finder在线工具确定nm23的ORF序列，并翻译成氨基酸序列；利用ClustalX软件将该氨基酸序列与已公布的nm23氨基酸序列进行同源性比对；用MEGA 4.0软件的邻位法（Neighbor-Joining）构建系统进化树；用ExPASy Proteomics Server所提供的ProtParam tool蛋白质分析软件分析氨基酸序列；使用Signal 3.0 Server预测信号肽，TMHMM在线工具预测氨基酸跨膜区域。

1.2.4 实时荧光定量PCR（qPCR）分析 利用qPCR分析nm23在三疣梭子蟹不同组织及卵巢发育过程中的表达水平变化。根据克隆得到nm23的cDNA全长设计一对荧光定量引物NM23YG-F、NM23YG-R检测nm23基因表达水平，设计actin-F和antin-R（表1）用以扩增三疣梭子蟹β-actin基因（FJ641977）作为内参。制作标准曲线用于验证nm23基因和β-actin基因引物的扩增效率。按照SYBR®Premix Ex TaqTMII kit使用说明进行qPCR反应。反应条件为：95℃ 2 min；95℃ 5 s，53.2℃ 20 s，68℃ 30 s，共40个循环。设定熔解曲线用于保证产物的特异性，条件如下：55-95℃，每秒上升0.2℃。每个cDNA重复3个平行。数据用方法表示。采用 2-△△Ct方法［28］计算目的基因相对表达量。选取实验组中的一个重复为1，其他组的数值以该重复的倍数来表示。用SPSS Statistics软件进行单因素方差（ANOVA，Duncan’ s test）分析，利用Excel对统计结果进行作图，P<0.05表示显著性差异。

2 结果

2.1 三疣梭子蟹nm23基因的cDNA全长及序列分析

将测序结果进行拼接得到777 bp的三疣梭子蟹nm23 cDNA全长序列（GenBank登录号：KP027331）。该序列包括145 bp的5' 端非编码区、176 bp的3' 端非编码区和456 bp的开放阅读框（ORF），编码151个氨基酸（图1）。推导的氨基酸经ExPASy（http://ca.expasy.org/）网站在线Prot Param预测其分子式为C761H1184N204O220S10，分子量大小约为17 031.6 Da，预测等电点为7.70，亲水性总和（Grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.353，属于亲水性蛋白；利用Signal 3.0 Server和TMHMM在线分析发现该氨基酸序列不含信号肽，且无跨膜结构域。

Blast结果显示，推导的氨基酸序列与拟穴青蟹（Scylla paramamosain）的nm23一致性最高（99%）；其次为中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），达到98%；与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、斑节对虾（Penaeus monodon）和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）nm23的一致性均为90%。该氨基酸序列由一个NDPK结构域组成，包含11个NDPK活性位点（Lys-11、Tyr-51、Phe-59、Arg-87、Thr-93、Arg-104、Asn-114、His-117、Ser-119、Asp-120和Glu-128）和9个多肽结合位点（Val-15、Ile-20、Gly-21、Glu-22、Lys-25、Glu-28、Met-37、Lys-38和Tyr-39），其活性位点结构域为NXXH［G］SD（图2）。根据三疣梭子蟹nm23及其他物种的nm23氨基酸序列，利用MEGA 4.0软件的邻接距离（Neighbor-joining）法构建进化树，结果（图3）显示，所有物种的第一类nm23和第二类nm23分别聚为一支；三疣梭子蟹nm23与其他甲壳动物nm23聚在一起，均属于第一类nm23，且与脊椎动物的nm23的1和2亚型亲缘关系较近。

图1 三疣梭子蟹nm23全长cDNA核苷酸序列和编码区氨基酸序列

图2 三疣梭子蟹nm23与其他物种nm23-1/2同源序列的氨基酸序列比对

2.2 三疣梭子蟹nm2 3在不同组织中的表达差异

实时荧光定量PCR（qPCR）结果（图4）显示，nm23在三疣梭子蟹各组织中均有表达，其表达水平在眼柄（Es）、肌肉（Ms）和Y器（Yo）中最高，卵巢（Ov）和肝胰腺（Hp）次之，其他组织中nm23表达水平均较低。

图3 邻接法构建的基于nm23氨基酸序列的系统进化树

2.3 三疣梭子蟹nm23在卵巢发育中的表达水平变化

为了研究nm23在三疣梭子蟹卵巢发育过程中的作用，采集各发育期卵巢检测其中nm23的相对表达水平。结果（图5）显示，在三疣梭子蟹卵巢发育过程中，nm23在I期表达水平最高，显著高于其他各期（P<0.05）；随后其表达量开始逐渐下降，至V期降至最低。

3 讨论

本研究根据三疣梭子蟹转录组文库中的nm23同源序列，利用RACE技术，首次克隆获得了三疣梭子蟹nm23的全长cDNA序列。推导的nm23氨基酸序列由一个典型的NDPK区域组成，该区域包含11个NDPK活性位点、9个多肽结合位点和1个保守的NDPK活性位点结构域。三疣梭子蟹nm23与其他甲壳动物的nm23一致性较高，均在90%以上，与脊椎动物第一类nm23的一致性也达到70%以上。进一步构建系统进化树发现甲壳动物nm23与第一类nm23聚为一支，这表明目前甲壳动物克隆获得的nm23均为第一类nm23，甲壳动物中是否存在第二类nm23还需进一步证实。值得注意的是，在已知甲壳动物的nm23中，罗氏沼虾nm23拥有延伸的C末端和N末端，其可能是甲壳动物nm23的另一种亚型［25］，该亚型是否存在于三疣梭子蟹中还有待进一步研究。

与脊椎动物第一类nm23一样，甲壳动物nm23也广泛存在于各个组织中，但在不同物种中，其主要表达的组织并不一致。例如，在罗氏沼虾中，nm23在肌肉中、肝胰腺、精巢和卵巢中均有较高的表达［25］；在中华绒螯蟹中，除肌肉和肝胰腺外，nm23在鳃和心脏中也有较高的表达［24］。本研究中，三疣梭子蟹nm23在肌肉、卵巢和肝胰腺中均有较高的表达，与之前报道相符；但不同的是，nm23在三疣梭子蟹的Y器和眼柄中也存在较高的表达，这可能与罗氏沼虾和中华绒螯蟹中并未检测nm23在Y器和眼柄中的表达情况有关。在斑节对虾中，nm23虽然在雌蟹眼柄中表达水平最高，但在雄蟹眼柄中却极低［26］；且其在卵巢和肝胰腺中表达水平较低，与本研究结果也不一致。因此，nm23在甲壳动物中的组织分布特性并不明确，可能因种而异。

三疣梭子蟹的卵巢发育过程主要经历了卵原细胞的增殖（I期）、内源性卵黄合成期（II）、外源性卵黄合成期（III）、近成熟期（IV期）和成熟期（V期）等阶段［27］。三疣梭子蟹nm23在卵巢发育的I期表达水平最高，之后随着卵巢发育的进行，其表达水平逐渐下降，并在成熟期降至最低。该结果与罗氏沼虾nm23的研究结果相一致［25］，这表明nm23可能抑制甲壳动物的卵巢发育过程。此外，Hsieh和Wu［29］认为nm23可以通过抑制B型细胞周期蛋白（Cyclin B）从而阻止细胞从G2期向M期转化。三疣梭子蟹nm23是否也是通过Cyclin B实现对卵母细胞减数分裂的负向调控还需进一步研究。

图4 三疣梭子蟹nm23在不同组织里的表达水平

图5 三疣梭子蟹第一次卵巢发育过程中nm23在卵巢中的表达水平变化

4 结论

本研究首次克隆获得了三疣梭子蟹nm23基因的全长cDNA序列，其氨基酸序列与已知甲壳动物的nm23一致性达到90%以上，且与哺乳动物第一类nm23亲缘关系较近。组织差异表达分析显示，三疣梭子蟹nm23在三疣梭子蟹各组织内均有表达，其表达水平在眼柄、肌肉和Y器中最高，卵巢和肝胰腺次之。在三疣梭子蟹卵巢发育过程中，卵巢中nm23的表达水平在Ⅰ期最高，之后逐渐下降，在成熟期降至最低，这表明nm23可能参与调控三疣梭子蟹的卵巢发育。

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（责任编辑 狄艳红）

Cloning and Expression Analysis of Gene nm23 during Ovarian Development of Portunus trituberculatus

XU Qing ZHU Dong-fa XIE Xi QIU Xi-er SHEN Xi-quan
（The School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）

Nm23 is a family of genes encoding the nucleoside diphosphate（NDP）kinase，which functions in a wide variety of biological processes，including growth，development，differentiation，and tumor metastasis. In this study，based on the nm23 homologous sequence in the transcriptome dataset of Portunus trituberculatus，the full-length cDNA of P. trituberculatus nm23 was obtained using the rapid amplification of cDNA ends（RACE）. The full-length cDNA（GenBank accession number KP027331）was 777 bp，encoding for a protein of 151 amino acids with one typical NDP kinase domain that harbored all the crucial residues for nucleotide binding and enzymatic activity. The deduced amino acid sequence of P. trituberculatus nm23 exhibited more than 90% identities with that of other crustaceans，and more than 70% identities with the nm23 of group I of vertebrates. The phylogenic tree constructed based on nm23’s amino acid sequences indicated that the crustacean nm23 belonged to the group I（nm23-1），which was separated from the nm23 of group II（nm23-2），moreover，the nm23-1 and nm23-2 were close. The expression levels of P. trituberculatus nm23 in different tissues and during the ovarian development were detected by quantitative real-time PCR（qPCR）. The results showed that nm23 was ubiquitously expressed in all tissues examined，its mRNA level was the most abundant in eyestalk，muscle and Y-organs，and second in ovary and hepatopancreas. During the ovarian development，the nm23 was mostly expressed at stage I，then declined along with the development of ovaries，and to the minimum at stage V，suggesting that the nm23 had the potential role in the ovarian development of P. trituberculatus.

Portunus trituberculatus；nm23；gene cloning；ovarian development；gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.012

2015-07-10

国家自然科学基金项目（41376152，40976098），浙江省自然科学基金项目（LY13C190006）

徐晴，女，研究方向：甲壳动物内分泌学；E-mail：634605585@qq.com

朱冬发，男，教授，研究方向：甲壳动物遗传育种；E-mail：zhudongfa@nbu.edu.cn