黄鳝出血病病原菌的分离鉴定及药敏试验

庄健

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

张治平

(湖北省荆州市水产技术推广中心，湖北 荆州 434000)

曾明华，高帅

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

杨代勤

长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北 荆州 434025



黄鳝出血病病原菌的分离鉴定及药敏试验

庄健

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

张治平

(湖北省荆州市水产技术推广中心，湖北 荆州 434000)

曾明华，高帅

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

杨代勤

长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北 荆州 434025

[摘要]通过对患出血病黄鳝(Monopterus albus)的血液进行常规细菌学检查、病原菌的形态观察及生理生化特性分析，结果表明：该病原菌为嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 。回归感染试验和药敏试验结果表明：该病原菌对四环素、氯霉素、诺氟沙星和强力霉素高度敏感，对青霉素、安卡西林、头孢菌素耐药，对妥布霉素、新霉素、氧氟沙星、多粘菌素、庆大霉素、克林霉素、卡那霉素、先锋霉素Ⅵ号和红霉素、复方新诺明呈现出不同程度的敏感性。因此，四环素、氯霉素、诺氟沙星和强力霉素可作为治疗此病的备选药物。

[关键词]黄鳝 (Monopterus albus)；出血病；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)；分离鉴定；药敏试验

黄鳝出血病又称出血性败血症，俗称“赤斑病”、“打印病”，是黄鳝养殖中常见的细菌性疾病，从早春至10月底均可发生，此病流行广，发展快，死亡率高。陈怀青等[1]首次报道了此病病原菌为嗜水气单胞菌。之后，沈锦玉等[2]通过对养殖黄鳝的肝、肾分离的细菌进行生理生化鉴定，得到了类似的结果。而杭州地区从患出血病黄鳝体内分离得到病原菌，经鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)[3]和温和气单胞菌(Aeromonassobria)[4]。为了给黄鳝出血病的防治提供参考依据，本研究对该病病原菌进行了分离鉴定、人工感染试验以及药敏试验。现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1材料

试验所用黄鳝由长江大学动物科学学院黄鳝研究所提供。

1.2方法

1.2.1菌株分离

选取自然发病且出血病症状明显的病鳝，用75%的酒精对病鳝体表进行消毒，解剖无菌取样采集病鳝的血液，划线接种于普通营养琼脂平板。28℃恒温培养24h后，随机挑选特征鲜明的单菌落作纯化培养。细菌分离纯化方法按照《常见细菌系统鉴定手册》[5]和《兽医微生物生物学试验指导》[6]的方法进行。将纯化后的菌株分离，接种到琼脂斜面培养基上，28℃恒温培养24h后，4℃保存备用。

1.2.2病原菌的鉴定

纯培养菌株经20h 斜面培养后作革兰氏染色，然后进行菌落、菌体形态观察，并移植于普通肉汤中进行生长特性观察。生理生化反应测定及细菌鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[5]和《伯杰细菌鉴定手册》[7]中的方法进行。

1.2.3回归感染试验

选取规格一致的健康黄鳝，平均体重(100±5)g/尾。在室内暂养1周随机分组后，进行试验。将分离到的细菌接种于新鲜营养琼脂斜面，28℃恒温培养16～18h后，用无菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液，用比浊法将菌悬液细菌浓度稀释为1×106CFU/mL。选取10尾健康黄鳝，按0.5mL/尾腹腔注射菌悬液，对照组注射等量生理盐水。试验期间保持水温24～26℃，观察记录黄鳝的发病情况。对发病黄鳝进行病原菌的分离纯化并进行鉴定。

1.2.4药敏试验

采用药敏纸片法检测。调制浓度为1×106CFU/mL的菌悬液，均匀涂布在琼脂平板上，贴上药敏纸片。具体操作及结果判定参照文献[6,8]的方法进行。

2结果与分析

2.1细菌分离鉴定

注：P为阳性；N为阴性。

表3　黄鳝感染试验

分离得到的病原菌经纯培养，菌落的形态特征见表1。菌落呈圆形，微凸，表面光滑，边缘整齐，半透明。分离菌株为革兰氏染色阴性短杆菌，菌体直，两端钝圆，无荚膜，无芽胞，多数单个存在，少数成双排列。极生单鞭毛，有运动性。

根据上述待测菌株形态、培养特性及表2体现的生理生化特性测定结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[7]、《常见细菌系统鉴定手册》[5]可知，该菌株与嗜水气单胞菌基本一致，故认为待测菌株应为嗜水气单胞菌。

2.2回归感染试验

由表3可以看出，将分离得到的纯种病原菌注射于健康黄鳝腹腔，10尾黄鳝在3d内全部发病死亡，死亡率100%，并出现与自然发病的出血病黄鳝同样的病症，对照组健康无死亡。从发病黄鳝体内分离得到同样的菌种，而对照组没有分离出该病原菌。证明该嗜水气单胞菌分离株是黄鳝出血病的病原菌，具有较强的致病力。

2.3药敏试验

分离菌对17种药物的药敏试验结果见表4。由表4可以看出：该株病原菌对氯霉素、四环素、诺氟沙星和强力霉素等4种药物高度敏感，对妥布霉素、新霉素、氧氟沙星、多粘菌素、庆大霉素、克林霉素、卡那霉素、先锋霉素Ⅵ号、红霉素和复方新诺明表现出不同程度的敏感性，对青霉素、安卡西林、头孢菌素等3种药物耐药。

表4　 分离菌株对各种药物的敏感性

注：H表示高度敏感；M表示中度敏感；F表示不敏感。

3讨论

目前我国报道的黄鳝出血病的病原菌有嗜水气单胞菌[1,2,9,10]、产碱假单胞菌[3]和温和气单胞菌[4]。本研究从长江大学动物科学学院黄鳝水产研究所患出血病的黄鳝中分离得到的病原菌，经初步鉴定为嗜水气单胞菌，与陈怀青等[1]的试验结果相似。嗜水气单胞菌在自然界尤其是在水中广泛分布，为正常共栖菌，是一种条件致病菌，是人、兽、鱼共患病病原[11]。当养殖水体水质恶化、饵料营养不良或外伤出现时，均可导致该病的暴发[12]。有研究认为湖北环毛蚓是其原发性的致病因子[9]。因此，黄鳝养殖过程中引种要严格把关，选择健康优质的苗种筛选和暂养观察，剔除弱残苗种，放养前对鳝体消毒；高温季节确保水源稳定，种植水草，定期对水体消毒，改善水质条件；日常投喂过程中，尤其是饵料中加环毛蚓的，应定期拌内服药投喂，增强黄鳝的抵抗力；减少不规范的操作对黄鳝造成的伤害；加强日常观察，早发现早治疗。

本研究的药敏试验结果显示：该株病原菌对氯霉素、四环素、诺氟沙星和强力霉素等4种药物高度敏感，对妥布霉素、新霉素、氧氟沙星、多粘菌素、庆大霉素、克林霉素、卡那霉素、先锋霉素Ⅵ号、红霉素和复方新诺明表现出不同程度的敏感性，对青霉素、安卡西林、头孢菌素等3种药物耐药。与陈怀青等[1]、何智[13]、彭彬等[12]和高明辉等[14]报道的嗜水气单胞菌对氯霉素、诺氟沙星等高度敏感，对青霉素、氨苄西林等耐药的特征相符。而对多粘菌素、复方新诺明和四环素类药物的敏感性各地情况不一。因此，在生产实践中，要根据具体情况合理地选用药物，以期用最小的成本达到最佳的防治效果，使养殖利益最大化。

[参考文献]

[1]陈怀青，陆承平.嗜水气单胞菌：黄鳝出血性败血症的病原[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(4)：21～23.

[2]沈锦玉，刘问，钱冬，等.养殖黄鳝“出血病”病原的研究[J].浙江海洋学院学报(自然科学版)，2001，21(2)：120～122.

[3]马有智，舒妙安.黄鳝产碱假单胞菌的分离与鉴定[J].淡水渔业，2000，30(5)：33～34.

[4]徐海圣，舒妙安.黄鳝温和气单胞菌病病原的分离鉴定及免疫应答[J].中国兽医学报，2003，23(3)：240～242.

[5]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[6]姚火春.兽医微生物生物学试验指导[M].北京:中国农业出版社，2002.

[7]Krieg N R,Holt J G.Bergey’s manual of systematic bacteriology (volume 1)[M].Bltimore: Williams & Wilkins,1984.

[8]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial sus-ceptibility testing.Twentieth Informational Supplement(M45-P)[S].Wayne,PA.Clinical and laboratory standards Institute,2005.

[9]杨明生.黄鳝出血性败血病传染的防治[J].孝感师专学报(自然科学版)，1998，18(4)：70～74.

[10]韩伟，陈德芳，赵金全.一例黄鳝出血病的诊断与治疗[J].科学养鱼，2012，(10)：64.

[11]陆承平.致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述[J].水产学报，1992，16(3)：282～288.

[12]彭彬，杨光友，陈晓利，等.黄鳝出血病病原菌的分离与鉴定[J].淡水渔业，2011，41(3)：72～76.

[13]何智.黄鳝出血病病原菌的分离、鉴定和组织病理学观察[D].雅安：四川农业大学，2009.

[14]高明辉，严玉萍，袁昌果，等.黄鳝嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J].畜牧兽医科技信息，2014，(8)：29～30.

[收稿日期]2015-06-03

[基金项目]湖北省科技支撑计划项目(2015BBA235)；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目(T201503)。

[作者简介]庄健(1987-)，男，硕士生，研究方向为特种水产养殖。通信作者：杨代勤，yangdaiq@163.com。

[中图分类号]S941.42

[文献标识码]A

[文章编号]1673-1409(2016)03-0023-03

[引著格式]庄健，张治平，曾明华，等.黄鳝出血病病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].长江大学学报(自科版) ，2016，13(3)：23～25.