胸腹水液基薄层细胞涂片中Ki-67的表达联合CA153、CYFRA211、CEA的检测与胸腹水良恶性质的相关性

王翠峰 任美英 付玉华 杨丽

胸腹水液基薄层细胞涂片中Ki-67的表达联合CA153、CYFRA211、CEA的检测与胸腹水良恶性质的相关性

王翠峰 任美英 付玉华 杨丽

目的 本实验通过选用单克隆抗体Ki-67标记胸腹水液基薄层细胞涂片，并联合定量分析CA153、CYFRA211及CEA等三项肿瘤标志物在胸腹水中的含量，对比这几种检测指标的不同检测组合的效能评价来鉴别胸腹水的良、恶性质。方法 本实验共收集恶性组胸腹水标本51例，良性组胸腹水标本34例，对每份标本部分采用免疫细胞化学染色法检测液基薄层细胞涂片中Ki-67表达及半定量分析，其余部分检测肿瘤标志物CA153、CYFRA211及CEA的含量，后分别对4项指标单独及联合检测的不同组合进行效能评价。结果 恶性组中胸腹水Ki-67的表达分析及CYFRA211、CEA含量均高于良性胸腔积液组，差异有统计学意义（P<0.05）。在效能评价中，4个项目单独检测胸腹水时，敏感度和阴性预测值最低的是CA153、特异性最低的是CYFRA211、阳性预测值最低的是CEA。当两两组合检测中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，可达98.0%，但特异性最低。而Ki-67和CA153联合检测，特异性尽管最高，达76.4%，但敏感性却最低，为88.3%。而在3项组合中，每种组合均可将敏感性提高到90.0%以上，但特异性却比单项检测或两两结合检测的结果均低。而当以上4项指标共同联合检测时敏感度为100.0%，而特异性却为几种检测方式中的最低，为44.1%。结论 分析所测结果，细胞免疫组化Ki-67的表达联合CEA、CYFRA211检测可将恶性胸腹水诊断的敏感性提高到98.0%，而特异性也可达到70.5%，从而成为在鉴别胸腹水良、恶性质中最大互补作用的项目组合。

Ki-67；胸腹水；液基薄层细胞制片；免疫细胞化学染色；肿瘤标志物

胸腹水是临床上常见的一种并发症，可由许多疾病引起，其中由于恶性肿瘤引起的胸腹水，是恶性肿瘤侵袭和转移的一个突出的临床表现，约占所有胸腹水病因的10%～15%，患者出现恶性胸腹水常提示肿瘤已到终末期，预后极差[1]。故对于临床来说，准确判断积液的性质对疾病的诊断和治疗至关重要。但目前对胸腹水性质判断仍未有较有效的方法。而本实验通过选用单克隆抗体Ki-67标记经液基薄层方法（TCT）制备的胸腹水的细胞学涂片，并联合定量分析CA153、CYFRA211及CEA等3项肿瘤标志物在胸腹水中的含量，试通过对比这几种检测指标的联合检测来寻求鉴别良、恶性胸腹水的客观指标，以指导临床治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验所用的胸腹水标本均来自内蒙古包头医学院第一附属医院的检验科细胞病理室，2011年1月～2012年6月入院且为初治的患者，同时最终诊断明确者85例，其中恶性胸腹水（恶性组）51例，男25例，女26例，年龄34～86岁，平均（61.36±9.1）岁，均经胸腹水脱落细胞学检查、闭式经皮胸膜活检、纤维支气管镜检查、浅表淋巴结穿刺等检查获得病理组织学或细胞学依据而确诊。良性胸腹水（良性组）34例，其中男18例，女16例，年龄33～80岁，平均（58.16±10.7）岁，良性组均根据病史、临床表现、胸腹水细菌性检查、结核菌素试验、X线胸片或胸部CT检查、闭式经皮胸膜活检临床相关资料的综合分析确定诊断。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 取临床新鲜抽取的胸腹水100～200 mL,分装5～10mL标本用于3项肿瘤标志物的定量检测，其余量用于细胞涂片的制作。

1.2.2 制作液基涂片 将收集到的新鲜的胸腹水标本混匀后离心，弃去上清将约1～2mL沉淀物加入到EasyFix细胞固定液中，按TCT制片方法进行制片，每一份标本至少制片5张。取1～2张玻片标本进行瑞氏染色，其余的通过乙醇固定液固定20 min用于免疫细胞化学染色。

1.2.3 免疫细胞化学染色 恶性组和良性组的玻片标本均采用免疫组化SP法，以PBS液代替一抗作阴性对照，阳性对照用已知Ki-67阳性的肺癌切片作。按照试剂说明书操作步骤进行免疫细胞化学染色。鼠抗人Ki-67单克隆抗体（即用型）、即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒、DAB显色试剂盒均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.4 胸腹水中肿瘤标志物CA153、CYFRA211及CEA含量检测 采用化学发光法严格按照罗氏全自动化学发光免疫分析仪和试剂的SOP文件和使用说明书进行操作。

1.2.5 图像分析及统计学处理 单克隆抗体Ki-67主要定位于增殖期的细胞核。细胞核呈棕黄色颗粒即为Ki-67阳性表达，阴性细胞的细胞核被苏木素复染为蓝紫色。每张玻片随机计数10个高倍视野（×200）进行阳性细胞计数：阳性细胞标记指数(labeling index,LI)=视野阳性细胞数/100×100%，分组统计时采用平均标记指数(MLI)。再用捷达801图像分析系统分别测定良性组和恶性组胸腹水中阳性细胞面积积分光密度值（area integrated optical density,AIOD），用阳性积分光密度值/ μm2表示Ki-67蛋白表达的相对含量，每张涂片在光学显微镜高倍视野下，随机测2个单位面积，并记录数据。

1.2.6 标志物检验判断标准 各项肿瘤标志物正常值分别为：CEA<9.8ng/mL，CYFRA211：<3.3ng/mL，CA153<28U/mL，超过正常值即判断为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件包对所有数据进行统计学分析，对于Ki-67的实验数据均数比较采用t检验。计数资料采用“%”表示，应用χ2检验。因肿瘤标志物的数据为偏态分布资料，故统计肿瘤标志物水平用中位数±四分位数间距表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 恶性组与良性组的一般临床资料比较 2组患者在性别和年龄构成上均差异无统计学意义。见表1、表2。

表1 恶性组与良性组性别构成比较

表2 恶性组与良性组年龄比较（x±s）

2.2 胸腹水良、恶性组免疫细胞化学染色检测Ki-67表达结果 51例恶性胸腹水标本中42例见到Ki-67抗原的阳性表达，表达的阳性率为82.3%；良性组的仅为11.7%，且均为弱表达，二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。见表3、表4。后经图像分析系统分析结果显示胸腹水中ki-67阳性细胞平均标记指数（MLI）结果以及阳性细胞的面积积分光密度值均显示出良性组与恶性组相比差异有统计学意义（P<0.05）。见表5、表6。

表3 良恶性胸腹水中Ki-67表达的结果

表4 良恶性胸腹水中Ki-67免疫组化染色结果

表5 良恶性胸腹水中Ki-67阳性细胞MLI结果（x±s）

表6 Ki-67在良恶性胸腹水中阳性细胞面积积分光密度值（x±s）

2.3 胸腹水良、恶性组肿瘤标志物水平比较 恶性组中胸腹水CEA、CYFRA211均高于良性胸腔积液组，差异有统计学意义（P<0.05）。而CA153在良、恶性胸腹水中的测定结果差异无统计学意义。见表7。

表7 良、恶性胸腔积液组胸水肿瘤标志物水平比较（M±Q）

2.4 单项检测胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的效能评价 胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的四项检测项目中敏感度最低的是CA153、特异性最低的是CYFRA211、阳性预测值最低的是CEA、阴性预测值最低的是CA153。见表8。

表8 单项待测的敏感性、特异性、准确度和阳性预测值、阴性预测值

2.5 联合检测胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的效能评价 将4项指标进行多种组合，以良性胸腹水组为对照组，分别计算两两组合、3项组合、4项组合的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值。试验中只要有一个试验呈现阳性即诊断为阳性。在两项组合检测中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，可达98.0%，但特异性最低，为67.6%。而Ki-67和CA153联合检测，特异性尽管最高，达76.4%，但敏感性却最低，为88.3%。而在3项组合中，每种组合均可将敏感性提高到100.0%以上，但特异性却比单项检测或两两结合检测的结果均低。见表9。

表9 联合试验检测胸腹水中待测指标的敏感性、特异性、阳性预值、阴性预测值

3 讨论

胸腹水在临床上较常见，引起胸腹水的原因有多种，通过体格检查和影像学检查难以对其良性恶性进行有效地鉴别诊断。常规胸腹腔穿刺可以抽取胸腹水进行常规、生化、细胞学方面的检查，但各有不足之处。这就迫切要求人们寻找一种有效地方法，来准确鉴别良、恶性胸腹水。

Ki-67即细胞核相关抗原（nuclear-associatedantigen, ki-67），其功能目前认为与细胞有丝分裂有关，其高表达是细胞增殖活跃的重要标记，检测该抗原的表达有助于判断肿瘤的生物学特性[1-2]。本实验利于免疫细胞化学染色法检测了51例恶性胸腹水和34例良性胸腹水的液基细胞涂片标本中Ki-67阳性表达情况。统计学处理表明：在恶性胸腹水和良性胸腹水的液基细胞涂片中，Ki-67的细胞表达数量差异有统计学意义（P<0.01），在进行Ki-67 AIOD定量测定中，恶性胸腹水相对含量明显高于良性胸腹水，差异有统计学意义（P<0.01）。引起恶性胸腹水的绝大多数原因是肿瘤栓子种植于脏层胸膜、壁层胸膜或肿瘤胸腹膜转移，故胸腹水中富含肿瘤或核异质细胞，导致Ki-67在异常增生的肿瘤细胞或核异质细胞中明显表达，而正常的细胞中几乎无或很少表达[3]。而在胸腹水中少数间皮细胞见弱表达，可能与肿瘤或炎性等因素的刺激下，间皮细胞增生活跃，导致Ki-67的表达增加。

虽然免疫细胞化学染色结果显示多数恶性胸腹水中有Ki-67蛋白的表达，但仍有部分标本细胞中未见表达，从而使得Ki-67表达的敏感性只达到82.3%，特异性只有88.2%。可能原因有：由于Ki-67的表达具有细胞周期的依赖性，仅在细胞的G1后期出现，S、G2期升高，M期达峰值，G0期消失，如果肿瘤细胞处于细胞周期的G0期或G1的前期则无法检测到Ki-67的表达。另外，常规检测Ki-67表达所使用的标本多为组织切片，而本课题所使用的标本是通过TCT所制的脱落细胞学涂片，它的优势在于可以使细胞分散，大细胞团少，背景干净，减少了背景中的非特异性着色[4]，但劣势在于标本在收集和处理时，可能存在细胞中的抗原丢失，导致无法检测到Ki-67或表达较弱。所以为了提高诊断方法的敏感度、特异度及准确率，本实验进行了免疫细胞化学染色与肿瘤标志物的联合检测。

肿瘤标志物（Tumor marker）是存在于细胞、体液或组织中的，由肿瘤自分泌产生或肿瘤与宿主机体相互作用产生的一类物质，反映了恶性肿瘤的产生和发展过程及癌基因的活化程度。本课题所选择的3个肿瘤标志物包括CEA、CFYRA211、CA153。癌胚抗原（CEA）最初发现于成人结肠癌组织中，是一种结构复杂的可溶性糖蛋白。多数研究证实，细胞癌变时，相应染色体上的基因发生阻抑，致使原来被阻抑的基因在癌组织中重新活跃并产生CEA[5]。由于CEA的分子量大，在胸腔内形成的CEA不易进入血液循环，且未经肝脏代谢，因此恶性胸腔积液中CEA较高，出现也早。肺腺癌引起的胸腔积液中CEA升高最为明显，CEA对良恶性胸腹腔积液的鉴别有一定价值，但CEA有时在一些正常人及良性肿瘤患者的血清中也有不同程度的升高，本研究中CEA的敏感性为72.6%，特异性为79.4%，比其它研究结果稍偏低。

细胞角蛋白19片段（CYFRAF21-1）是一种酸性多肽，主要分布在肺泡上皮。当这些细胞发生癌变时，可释放CYFRA21-1进入血液循环，导致CYFRA21-1的血清水平升高。J.Niklinski等[6]研究显示：CYFRA211对鳞癌的敏感性（76.5%）较腺癌（47.8%）和SCLC（42.1%）显著增高（P<0.01,P<0.05）。它对非小细胞肺癌（NSCLC）的早期诊断、疗效监测和预后判断均有重要意义。我们对胸水中的CYFRA211进行检测，结果显示，恶性胸腹水中的水平较良性组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

CA153是一种由腺体分泌的粘蛋白，可以存在于多种腺癌内，如乳癌、卵巢癌、胰腺癌等，临床上常用于乳癌及卵巢癌的检测[7]。近年来对CA153在肺癌诊断中的作用已有报道，本研究显示其在胸水中敏感度较低，仅为43.2%，而特异性较高，为88.2%。考虑可能因为相关研究的恶性胸腔积液包含多例乳腺癌转移至胸膜病例，而本研究病例中乳腺癌的病例数较少，也可能对统计结果有一定影响，可做为一种联合检测指标。

本研究显示单项肿瘤标志物的检测有一定局限，为了克服单项检测的不足，本研究组将细胞免疫组化联合肿瘤标志物进行胸腹水的良、恶性质的判断，经过对数据的统计分析显示，在两项组合检测中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，但特异性最低。而Ki-67和CA153联合检测，特异性尽管高，但敏感性却很低。而在3项组合中，每种组合均可将敏感性提高到90%以上，但特异性却比单项检测或两两结合检测的结果均低，经对所有数据进行分析后，本研究组在Ki-67联合肿瘤标志物检测结果分析中发现Ki-67联合CEA和CYFRA211的敏感性和特异性均不是最高，但敏感性可达98%，而特异性在所有检测组合选择中位于偏高水平，可达70.5%，这3项组合是我们所选择的敏感性及特异性均理想的组合检测。

本研究的结论表明细胞免疫组化Ki-67的表达联合肿瘤标志物比单项检测在鉴别良、恶性胸腹水上有更高的敏感性和较好的特异性。而在联合检测中，尤以Ki-67联合CEA、CYFRA211检测可将恶性胸腹水诊断的敏感性提高到98%，而特异性也可达到70.5%，从而成为在鉴别胸腹水良、恶性质中最大互补作用的检测项目组合，进而使临床减少漏诊率和误诊率。

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Objective In this study, the choice of ki-67 monoclonal antibody marked pleural effusion and ascites’s cells smears by Thinlayer cytology test, and combining the quantitative analysis of joint CA153, CYFRA211 and CEA, such as three levels of tumor marker in pleural effusion and ascites, Comparative Effectiveness evaluation of combination of several different detection indicators to identify benign and malignant nature of pleural effusion and ascites. Methods In this study, samples were collected of 51 cases of malignant pleural and peritoneal effusions as the malignant group, and collected of 34 cases of benign pleural and peritoneal effusions as the benign group. Part of each samples Use immunohistochemical staining method to detect expression of Ki-67 in cells smears of malignant group and benign group by Thin-layer cytology test and semi-quantitative analysis. At the same time, the rest of the detection of tumor markers CA153, CYFRA211content CEA , Then each of the four indicators alone or in various combinations were detection effectiveness evaluation. Results Ki-67 expression and CYFRA 211, CEA levels In malignant group were higher than benign group, the difference was significant difference (P<0.05). In the evaluation of effectiveness, When four project testing pleural and peritoneal effusions alone, Sensitivity and negative predictive value is the lowest CA153, specificity is the lowest CYFRA211, positive predictive value is the lowest CEA. When pairwise combinations of the highest sensitivity in the detection is CYFRA211 and Ki-67, and up to 98.0%, but the specificity is low. Ki-67 and CA153 in specificity despite the highest, to 76.4%, but the sensitivity is lowest at 88.3%. In the three combinations, each combination may increase the sensitivity to 90.0%, but the specificity than single test or the results of pairwise binding assays were low. The sensitivity of the above four indicators together when combined detection of 100.0%, while specificity was detected in several ways to the lowest, to 44.1%. Conclusion Analysis of measured results, the expression of cell immunohistochemistry ki-67 Joint CEA, CYFRA211 detection sensitivity can be improved diagnosis of malignant pleural effusion to 98.0%, specificity can also be reached 70.5%, become the largest combination of complementary role in differentiating nature of benign pleural effusion and malignant.

Ki-67; Pleural effusion and ascites; Thin-layer cytology test; Immunohistochemical staining method; Tumor marker

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.001

包头市社会发展科技支撑项目 （2011S2012-01-9）

内蒙古 014010 内蒙古包头医学院第一附属医院检验科 （王翠峰 任美英 付玉华 杨丽）