骨髓基质干细胞在兔DBM上增殖作用的研究

刘培林，王慧建，刘霄龙，陈书爱，张建锋濮阳市人民医院骨科，河南濮阳　457000



骨髓基质干细胞在兔DBM上增殖作用的研究

刘培林，王慧建，刘霄龙，陈书爱，张建锋
濮阳市人民医院骨科，河南濮阳457000

[摘要]目的分析骨髓机制干细胞在兔DBM上增殖作用。方法2014年3月—2015年7月，以3只大白兔为研究对象，根据Urist方法制备出DBM（同种脱钙骨基质），测定光密度（OD）值，绘制增殖曲线，分析复合培养后最佳修复软骨移植时机。结果SEM观察呈现高密度空隙网架结构，平均孔隙率为（60.19±6.1）%；平均孔径大小为（119.42±6.46）μm；兔DBM材料BMSCs体外复合培养后可见大量骨髓基质干细胞粘附，MTT法检测复合培养6d骨髓基质干细胞增殖达到稳定状态。结论兔脱钙骨基质具有三维网状结构和良好的细胞相容性是一种较好的软骨组织工程支架材料，最适合移植。

[关键词]脱钙骨基质；组织工程；支架材料；骨髓间充质干细胞

软骨的再生和修复能力极其有限，一旦损伤很难自行修复，组织工程学位解决这一难题提供了新途径[1]。种子细胞、支架材料等在组织工程中起到核心作用[2]，BMSCs是一种多功能细胞，在特定培养条件下可分化为成软骨、成骨等多种细胞[3]，目前被认为属于最佳种子细胞。为探讨骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质共同培养，2014年3月—2015年7月以3只大白兔为研究对象，观察BMSCs的生长情况及DBM的生物相容性，以兔为研究对象，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择成年新西兰大白兔（新乡医学院实验动物所中心）3只，雌雄不限，体重约12～15 kg。

主要试剂包括GIBCO公司提供L-DMEM、胎牛血清，主要仪器包括AMRESCO公司提供MTT、DMSO，美国OlympusIX71提供倒置相差显微镜，以及法国产飞利浦XL30ESEM提供扫描电镜。

1.2DBM的制备

实验严格依照《关于善待实验动物的指导性意见》要求。由市场购买家兔新鲜肩胛骨，取其松质骨，制备成圆饼形状，乙醇浸泡30 min，风干后备用。

1.3BMSCs的分离和培养

取新西兰大白兔3只经耳缘静脉，戊巴比妥麻醉，双侧髂嵴脱毛。双侧髂嵴穿刺，抽取骨髓，加入LDMEM培养基，混匀后，培养24 h后换液，观察其生长情况。原代细胞融合达到80%～90%，接种进入传代培养，第3代细胞进行下一步试验。

1.4DBM结构观察

取6块DBM，固定漂洗脱水，保存过夜，干燥，定向粘附于载物台上观察。

用扫描电镜观察DBM的表面结构。每个标本随机取10幅照片，计算平均孔径大小（Image J软件的Measure功能）和孔隙率（CS6软件的直方图（histogram）功能）。空隙面积采用像素（Pixel）表示，孔隙率=（整个照片的像素-骨小梁占的像素）÷整个照片的像素[4]。

1.5BMSCs与DBM体外复合培养及扫描电镜观察

取DBM若干块、再取6块24孔培养板，分为2组，BMSCs为A组：各板放置DBM材料，第3代BMSCs接种于24孔培养板的预湿材料上。B组做空白对照试验，每2 d更换液。观察其生长变化。随后分别在第2、4、6、8、12天时加入MTT 100 μL,测定各孔光密度（OD）值,并绘制生长曲线，电子显微下观察细胞粘附、增殖情况。

2　结果

2.1DBM的结构观察

DBM支架材料肉眼可见呈现白色海绵状，表面多孔，孔隙大小不一，相互连接，布满网状结果，软件测定平均孔隙率为（60.19±6.1）%；平均孔径大小为（119.42± 6.46）μm。

2.2倒置相差显微镜及SEM的观察

倒置相差显微镜观察可见A组1 h后细胞开始贴壁，48 h开始增殖。DBM周围存在大量细胞，培养时间延长数量逐渐增多。SEM观察，A组培养2 d DBM细胞大量生长，铺满表面，呈长梭形状，培养6 d细胞明显增多，细胞相互交叉重叠（图1）。B组孔隙相互交通，呈现蜂窝孔隙状结构（图2）。

图1　A组培养6 d时SEM观察

图2　B组培养6 d时SEM观察

2.3绘制BMSCs在DBM上的生长曲线绘制

分别在第2、4、6、8、10、12天测定OD值，在培养6 d时，增殖稳定，A组在6d达到最高，生长停滞，然后细胞强度下降，见表1。

表1　OD值变化

3　讨论

BMSCs来源广泛，体外培养时增殖能力强，一直被认为是软骨组织工程有前途的种子细胞。DBM是目前研究的比较热门的一种骨组织工程材料，大量研究结果证实DBM可应用于软骨缺损修复。DBM是同种异体骨通过脱钙、脱脂、处理得到，去掉了矿物质、脂质成分同时保留了骨基质中以骨形态发生蛋白（BMPs）为主的具有诱导软骨形成作用以及胶原[5]。

在组织工程中，种子细胞和复合体属于核心环节，近几年生物材料相容性研究中多采用体外细胞培养，检测增殖情况方法[6]。培养BMSCs和支架材料体外复合体得到软骨，复合时机是关键环节，时间过早，移植后容易被冲走，减少复合体数量。时间过晚，细胞活性大大降低，难以形成软骨组织。形成生物材料复合物后，移植到缺损部位，形成有功能组织，达到修复组织效果。在该组分析中，采用扫描电镜发现，DBM上细胞具有很好的伸展、增殖，细胞突起交错，虽然DBM存在部分不足，但是不会影响细胞增长，符合软骨工程支架材料要求。

该组制备DBM中参照Urist MR[7-8]试验方法，通过检测结果显示孔隙相互交通，平均孔隙率为（60.19± 6.1）%；平均孔径大小为（119.42±6.46）μm，能够提供足

够的内表面积和空间，有利于细胞增殖，并且具有一定的力学强度[9]。祝联等人[10]在分析骨髓基质干细胞与珊瑚复合物体内移植时间中认为培养时间的延长会相应降低细胞功能。在该组分析中，测定种子细胞增殖稳定状态时间，结果表明A组DBM上在第6天时细胞增殖达高峰，所以我们认为第6天时是有利于软骨缺损的最佳时机。

综上，兔脱钙骨基质具有三维网状结构和良好的细胞相容性是一种较好的软骨组织工程支架材料，DBM与BMSCs复合培养6d，BMSCs增殖达到稳定，最适合移植。兔DBM支架材料解决了热弄合成孔径大小等问题，保持良好的生物相容性，具有很大应用前景，能够为下一步关节腔内软骨缺损移植和临床提供研究依据。

[参考文献]

[1]王翠芳,冯万文,武天佑，等.软骨组织工程种子细胞源的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2007,15（6）:441-443.

[2]Wegener B,Schrimpf FM,Bergschmidt P,et al.Cartilage regeneration by bone marrow cells-seeded scaffolds[J].J Biomed Mater Res A，2010，95（3）:735-740.

[3]吕晶,柯杰,王琳,等.与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15（19）:3421-3426.

[4]李彦林，杨浩，韩睿，等.三种生物骨衍生材料修复节段性骨缺损的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2005，19 （2）:118-123.

[5]Zimmermann G,Moghaddam A.Allograft bone matrix versus synthetic bone graft substitutes[J].Injury,2011,42（S2）:16-21.

[6]Wilke A，Orth J，Lomb M，et al.BioeomPatibility analysis of different biomaterials in human bone marro cell cultures[J].J Biomed Mater Res，1998，40（2）:301-306.

[7]Terada S，Sato M，Sevy A，et al.Tissue engineering in the twenty first century[J].Yonsei Med J，2000，14:685-689

[8]Urist MR.Bone morphogenesis in implants of insoluble bone gelatin[J].Proe Nat Acad Sci USA,1973,70:3511-3526.

[9]聂芳菲，潘柏林，李健宁.脱细胞基质在软骨组织工程中的应用[J].中国修复重建外科杂志，2009，23（4）:501-504.

[10]祝联，周广东，陈付国，等.骨髓基质干细胞与珊瑚复合物体内移植时间的研究[J].中华实验外科杂志，2004，21（l: 10-13.

临床医学

Analysis of Value-added Function of Bone Marrow Stromal Stem Cells in Rabbit DBM

LIU Pei-lin,WANG Hui-jian,LIU Xiao-long,CHEN Shu-ai,ZHANG Jian-feng
Department of orthopedics,Puyang People's Hospital,Puyang,Henan Province,457000 China

[Abstract]Objective To analyze the value-added function of bone marrow stromal stem cells in rabbit DBM.Methods From March 2014 to July 2015,3 big white rabbits were selected as the research object,DBM（demineralized allogeneic bone matrix）was prepared according to the Urist method,the optical density（OD）value was detected,the value-added curve was drawn and the best repair cartilage transplantation after compound culture was analyzed.Results High density space truss structure was presented by SEM observation,the average porosity was（60.19±6.1）%and the average pore diameter size was（119.42±6.46）μm,a large number of bone marrow stromal stem cells adhesion was seen on the rabbit DBM materials after BMSCs compound culture in vitro,the value-added of bone marrow stromal stem cells?reached a steady state after 6d of compound culture by the detection of MTT method.Conclusion Rabbit DBM has a three-dimensional network structure and good cell compatibility,which is a good cartilage tissue engineering scaffold material and most suitable for transplantation.

[Key words]Decalcified bone matrix;Tissue engineering;Scaffold material;Bone marrow derived mesenchymal stem cell

[中图分类号]R318.1

[文献标识码]A

[文章编号]1674-0742（2016）01（c）-0053-03

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.03.053

[作者简介]刘培林（1968-），男，河南濮阳人，硕士，副主任医师，主要从事骨科工作。

收稿日期：（2015-10-23）