生物样本中的砷形态分析研究进展

林琳，沈敏，马栋（.华东政法大学刑事司法学院，上海0004；.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海00063）



生物样本中的砷形态分析研究进展

林琳1，沈敏2，马栋2
（1.华东政法大学刑事司法学院，上海200042；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063）

摘要：不同形态的砷化合物毒性不同，以总砷为基础的检测及毒性评判方法已不能满足科学发展的要求。不同形态的砷化合物的毒性、代谢机制、检测技术等是当前国内外研究的热点，涉及法医毒物学、毒理学、环境保护、食品安全等领域。综述生物样品中砷形态分析的研究进展，包括生物样品中砷形态化合物的分离、鉴别和检测技术，以期推动探究生物体内砷形态的代谢机制和毒性作用，关注其在法医毒物鉴定中的应用价值。

关键词：砷形态化合物；砷形态分析；生物检材；前处理技术；分析技术；综述

砷及砷化合物自古以来是法医毒物学的关注重点，中外历史上不乏砷化物中毒致死的案例［1］。砷广泛分布于自然界中，在自然界中的丰度排第二十位［2］，长期暴露在砷环境下，可引起急、慢性砷中毒，严重时会导致基因突变、人体细胞癌变以及胎儿畸形。国际癌症研究机构（LARC）、美国疾病控制中心（CDC）已经将砷确定为第一类致癌物质［3］，砷同时也是全球重点监测的30种污染物之一［4］。

自然界中砷以不同的化合价形态存在，不同形态的砷化物具有不同的物化性质与生物毒性。因此，传统的总砷检测技术已不能满足鉴别砷形态化合物以及评估其毒性作用的要求，而砷的形态分析在法医毒物学领域具有特别重要的意义。

1　砷形态化合物及其毒性评估

1.1药理毒理

砷的存在形态总的来说可分为无机砷和有机砷，其毒性也各有差异。前者毒性比后者大，且无机砷中的三价砷的毒性是五价砷的60倍，是甲基砷（如一甲基砷酸和二甲基砷酸）毒性的70倍［6］。以砷化合物的小鼠半数致死量LD50计，其毒性顺序为：AsH3、AsIII、AsV、一甲基胂酸（Monomethylarsonic Acid，MMA）、二甲基胂酸（Dimethylarsonic Acid，DMA）、三甲基胂氧（Trimethylarsine oxide，TMAO）、砷胆碱（Arsenocholine，AsC）、砷甜菜碱（Arsenobetaine，AsB）［7］，后两者通常被认为无毒［8］。砷与体内蛋白质和多种氨基酸具有很强的亲和力，能与多种酶蛋白分子上的巯基或羟基结合，使酶失去活性，导致细胞内生物氧化过程发生障碍或使细胞分裂发生紊乱，严重时可使细胞死亡。砷可直接作用于神经系统，麻痹延髓的血管舒缩中枢。砷还可直接损害毛细血管，使之麻痹扩张，通透性增加，导致血浆渗出，甚至红细胞漏出现象。砷中毒时的胃肠炎症状是毛细血管极度扩张及受损的结果，砷中毒还可导致严重的呕吐、腹泻使水分及电解质大量丢失，引起脱水、酸中毒、低钾及低钠血症。

1.2吸收、分布与代谢

砷化合物通过呼吸道、消化道和皮肤吸收进入人体，在人体产生蓄积。经肺和肠胃吸收的砷化合物经血流分布，储存于脑、肝、心、脾、肾、胸腺、胰腺、前列腺、甲状腺、主动脉、卵巢、子宫、肠壁、肌肉等全身各种组织中，其中以毛发、指甲、皮肤浓度最高［9］。

无机三价砷进入体内，主要是通过甲基化反应转化为MMA、DMA等毒性较低的甲基化砷形态排出体内，其中主要排出形式为DMA占60%～80%，MMA占10%～20%，其余10%～30%直接以无机砷排出［9］。无机三价砷在人体内转化，目前有氧化甲基化和还原甲基化两种学说，氧化甲基化学说认为三价砷进入体内在甲基转移酶的催化下，利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）作为甲基供体进行甲基化，转换为MMA、DMA，并最终转换为五价DMA排出体外［10］。而还原甲基化学说则认为三价砷与带巯基化合物及蛋白质、酶或还原型谷胱甘肽（GSH）结合，再在甲基转移酶和SAM作用下，进行还原甲基化代谢。同时砷-谷胱甘肽结合体arsenotriglutathione［iAsⅢ（GS）3］和单甲基砷酸-谷胱甘肽结合体monomethylarsenodiglutathione［MMAⅢ（GS）2］还可以被细胞膜转运蛋白-多药耐药蛋白2/有机阴离子转运蛋白（MRP2/cMOAT）排泄到胆汁来降低肝脏或器官中的砷浓度［10］。

砷的甲基化代谢水平与体内各形态砷的相对比例、砷排泄效率及其蓄积程度直接相关。砷的甲基化代谢主要在肝脏进行［11］，人体排泄砷有以下几种途径：粪便排泄（900 μg/d）；尿液排泄（50 μg/d）；皮肤排泄等。生物样品的砷化合物检测对于中毒评价具有重要意义。人体在摄入砷后，血液中的半衰期十分短，大部分砷能在几个小时内从血液中消除，血液中可检测到无机砷、一甲基和二甲基砷化合物及砷胆碱。尿液的半衰期较血液长，约为4 d左右，主要有无机砷、五价一甲基砷和二甲基砷、三价一甲基砷和二甲基砷化合物，用无机砷和代谢产物甲基砷的总量，可对中毒状况进行评估。砷化物可以与毛发和指甲中巯基结合而稳定存在于毛发和指甲，其中以三价和五价无机砷为主要形态，也有报道检出其代谢物。头发和指甲中的砷可指示过去的砷暴露的程度，时间的长短取决于头发和指甲的生长速度［7］。因此，在司法实践中，可结合实际案情，选择不同的生物检材进行砷化合物检测，这对于推断中毒时间及中毒程度等法医学评价具有重要的价值。

2　砷形态化合物的稳定性

砷元素各形态之间会随样品基质和周围环境条件的改变而发生转化，因此对样品的贮存提出较为苛刻的要求以保证砷元素形态间不会发生转化。

2.1水溶液

据研究报道［7］：浓度为1mg/L的AsⅤ和AsⅢ水溶液在4℃时可长期保存。0.5～1mg/L的AsⅤ、AsⅢ水溶液在4℃时可稳定存在21d。100 μg/L MMAⅢ去离子水溶液在-20℃、4℃条件下，4月后约10%MMAⅢ被氧化，而室温下，3 d后约10%MMAⅢ被氧化，20 d后约80%被氧化。DMAⅢ水溶液在25℃、4℃或-20℃时分别放置10d、13d、15d后，发现DMAⅢ被氧化为DMAⅤ。由于MMAⅢ和DMAⅢ容易被氧化，保存稳定性较差，因此在样品保存过程中应予以关注。高浓度的MMAⅤ和DMAⅤ标准储备液（1000 mg/L）可在4℃下放置1年以上，低浓度的MMAⅤ和DMAⅤ（0.01～10 μg/L）可在室温下稳定保存5～6个月，在硝酸氧化体系中MMAⅤ和DMAⅤ可稳定存在。AsB于4℃条件下保存多年不变，而AsC水溶液在室温条件下，3 d内可被氧化为AsB［7］，两者经硝酸加热后可转化为TMAO，但最终转化为DMA。一般来说，高浓度（＞20 mg/L）砷元素各形态溶液在室温下可长时间保存。

2.2生物样本

在3℃时，尿液中AsⅢ、AsⅤ可稳定存在5 d。室温放置时，尿液中MMAⅢ可在一周内完全转化为MMAⅤ，其他温度条件下例如-20℃、4℃，尿样中的MMAⅢ稳定性也不高，两者中仅有在-20℃时相对比较稳定。而尿液中DMAⅢ极不稳定，在25℃、4℃和-20℃条件下DMAⅢ尿样分别放置1.5 h、12 h、17 h后被氧化为DMAⅤ。尿液中MMAⅤ和DMAⅤ稳定性相对较好，在-20℃、3℃和20℃可稳定存在30 d以上，更长时间的MMAⅤ和DMAⅤ保存稳定性取决于尿样的特性。另外刘博莹等［11］考察了反复冻融对尿砷形态稳定性的影响，低温（-20℃、-80℃）反复冻融3次后对尿样中各形态砷（无机砷iAs、MMA、DMA、三甲基砷TMA）进行检测未见明显改变。Todor等［12］对血液中2 μg/L的5种砷形态物质（AsⅢ、AsⅤ、AsB、MMA、DMA）做了稳定性研究，24 h后AsB含量上升，AsⅤ、MMAⅤ和DMAⅤ含量下降。更系统性的血液中砷形态稳定性需更进一步研究。

3　砷形态分析技术

3.1生物样品前处理技术

由于生物样本基质较复杂，直接进样会造成检测干扰、检测灵敏度降低、仪器寿命缩短等问题，因此在含砷生物样品检测前首先需要经过一系列样本前处理过程，再进行定性、定量分析。

尿液和唾液前处理相对较为简单，只需通过简单过滤就可达到检测要求，Todor等［12］用1%硝酸稀释尿样10倍后直接使用PRP-X100预柱和PRPX100（250 mm×4.1mm，Hamilton）阴离子交换柱高效液相色谱-电感耦合等离子质谱（HPLC-ICP-MS）进行检测。Yasuomi等［13］直接加相同体积流动相与尿液混溶后过滤取上清进样，采用HPLC-ICP-MS对AsIII、MMAV、DMAV检测。Chungang等［14］移取500 μL唾液样品，并与1mL去离子水涡旋混合超声后用0.45μm滤膜过滤后直接进样分析。

血液样本由于基质十分复杂，样本前处理过程也相对比较繁琐。Bin等［15］在对人血清和红细胞中所含砷进行形态分析时，将血液样本分离成血清和红细胞，并经除蛋白处理后于-4℃储存，采用HPLC-AFS分析前再经0.45μm薄膜过滤处理。Yasuomi等［13］将血清加相同体积乙腈沉淀蛋白，过滤后取上清液，再加相同体积流动相（10 mM丁烷磺酸钠/4 mM丙二酸/4 mM氢氧化四甲铵，pH=3.0）稀释，采用HPLCICP-MS对AsV、AsIII、MMAV、DMAV进行检测。Yuta等［16］将EDTA抗凝收集的血液样本于4℃下以1000×g离心10min，分离成血红细胞和血浆，血红细胞用磷酸盐缓冲盐水清洗两遍，-80℃环境下冻干；0.2 g血浆经10-kDa过滤膜超滤后取上清液进HPLC-ICPMS分析。Badal等［17］对血液样本以1500×g离心5 min，分离血浆和血红细胞，血浆与三氯乙酸（终浓度5.0%）混合保存冰浴1h后，20000×g离心20min，取上清液经0.45 μm过滤膜（Millex-HV）过滤后用HPLC-ICP-MS检测。对于血红细胞用磷酸缓冲盐溶液（pH=7.4）清洗三遍，冻干取0.50～0.80 g用5 mL冰冻甲醇水溶液（3:2 v/v）溶解，涡旋20 min，重复三次，最终提取物于-80℃保存3～4 h冻干，冻干物用超纯水溶解，离心过滤进HPLC-ICP-MS检测。Kanna等［18］取300μL山羊血用相同体积的乙腈混合振荡2 min，8 500×g离心10 min，取上清液经0.2 μm尼龙过滤膜过滤后直接分析。

Meiling等［19］将砷蛋白用20 mM醋酸铵水溶液（pH=8.0）进行蛋白酶消解，然后冰浴5 min，离心（12 000rpm）取上清液适当稀释，经离子对色谱柱分离，ICP-MS检测。Eric等［20］对肝细胞制备液直接采用12000×g离心12min后进样。

对于头发样本，Hongmei等［21］先用去离子水、丙酮清洗头发后吹干，取0.5 g头发与10 ml去离子水混合于聚丙烯管中，90℃加热萃取6h。过滤分离萃取液，于4℃存储过夜，第二天分析。Badal等［22］用国际原子能协会（IAEA）方法对头发样本进行清洗后，取0.05～0.1g头发样本，用超纯水浸湿提取，考察不同时间条件下砷物质浸出情况。头发样本于90℃水浴加热，浸出物通过0.45 μm针头式过滤器（Millex-HV）过滤后按时间间距分别进样检测。

对于样本的前处理，需要根据生物样品的特点具体处置。但理想的砷形态前处理技术都会要求良好的回收率，同时要保证砷的形态在样品处理过程中不受影响，并满足检测要求。

3.2形态分析技术

砷形态分析研究进展多年，分离技术已经逐渐成熟，主要有溶剂萃取法、离子交换法、氢化物发生法（HG）、毛细管电泳法（CE）、色谱法等［23］；检测技术早期多采用光度法［24-25］、中子活化分析、原子吸收光谱法（AAS）、原子荧光光谱法（AFS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等。联用技术的出现大大推动了砷形态分析的研究［26］，与单一的检测技术相比，联用技术选择性、灵敏度更高，逐渐成为砷形态分析的重要手段［27］。常用的联用技术有光谱分析法联用、高效液相色谱-质谱联用、离子色谱-质谱联用等。表1给出了近年来各分离技术与检测技术在砷形态分析中的应用实例。

表1　砷形态分离分析技术应用实例

目前常用于砷形态分析的联用技术为高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）。高效液相色谱法（HPLC）具有分离模式多、分离效能高、操作简便且易实现在线分析等优点［23-25，30-33］，而电感耦合等离子质谱（ICP-MS）具有干扰少、检测限低、灵敏度高、动态线性范围宽、能跟踪多元素同位素信号等优点［27，32-34］，两者联用进行元素形态的检测分析，效果较其他联用技术好。

Ruimin等［35］采用HPLC-ICP-MS联用技术，利用阴阳离子交换色谱柱的不同特性，分别分离尿液中AsIII、AsV、DMAV、MMAV和DMAIII、MMAIII、AsB，检出限达到了μg/L水平。Jens等［36］利用阳离子交换柱（ChromPackIonospher 5C 3.0 mm×100 mm，5 μm）成功分离尿液中DMA、AsB、TMAO、DMAA、TMAP、DMAE砷形态化合物。而Badal等［17］则是采用HPLCICP-MS联用技术，利用阴离子交换柱（ShodexAsahipak ES-502N 7C，7.6 mm×100 mm）对砷暴露的Sahadiarh村的41个血液、尿液、头发、指甲样本进行砷形态含量分析，证明尿液、头发、指甲样本对饮用水砷浓度呈正相关，并分别测定尿液、血液、头发、指甲样本中AsB、AsIII、AsV、MMAIII、MMAV、DMAIII、DMAV的不同比例，其中，头发、指甲样本中砷形态含样本含量最多是AsIII，分别是58.9%、62.4%，尿液、红细胞、血浆比例最大则是DMAV，分别是47.5%、77.5%、35.1%。并且Badal等［22］也对印度砷暴露West Bengal区域47个头发、指甲样本进行检测，更是证明在指甲、头发样本中所占比例最多的是AsIII。表2给出了近年来HPLC-ICP-MS在砷形态分析中的一些应用实例。

表2　HPLC-ICP-MS在砷形态分析中的实用实例

4　生物样本中砷形态分析的应用

4.1检材选择研究

研究人员通过探索除血液、尿液之外的生物检材来进行对砷形态含量的实时监控。例如陈保卫等［10］在砷的代谢机制、毒性和生物监测研究中发现唾液中砷浓度与饮用水砷浓度的相关性系数与尿液相近。Chungang等［14］对不同浓度砷暴露的唾液建立HPLC-ICP-MS检测方法，对AsV、AsIII、MMAV、DMAV、MMAIII、DMAIII进行分离，证实唾液用于分析体内砷各形态浓度的可行性。此外，相较于血液、尿液，唾液具有非侵害性取材的优点。

陈保卫等［10］还证实头发中砷的浓度与尿砷的浓度（r=0.75，p＜0.001）、饮用水中的浓度（r=0.74，p＜0.001）、砷的日摄入量（r=0.77，p＜0.001）都存在显著的相关性；且指甲中砷的浓度与水中砷的浓度显著相关（r=0.46，p＜0.001）（0.002-66.6 ng/mL）。Badal等［22］采集砷暴露地区人群头发和指甲，判断其是否可以成为检测砷暴露程度的生物检材。研究采取样本（n=47），用HPLC-ICP-MS联用技术进行检测，发现指甲中AsIII占58.6%，头发中占60.9%，并且指甲中检出DMAIII，而头发中未检出，又因头发可能存在外源性污染，因此指甲较头发更适合用于生物学评价。

因此除了血液、尿液常规生物样本外，在特殊情况下还可以在头发、唾液、指甲中进行砷形态的相关分析。

4.2毒理研究

砷是一种广泛存在的环境毒物，高剂量的砷暴露地区、环境，已经成为危害人类健康的全球性问题。

研究人员采用动物实验对不同形态砷含量进行检测，或者采集砷暴露的人群的生物检材进行砷含量检测。例如陈绍占等［37］取4周龄Wistar大鼠4只，体重（50±10）g，分别给药0.5%CMC（羧甲基纤维素钠）、0.3 g/kg、0.9 g/kg、2.7 g/kg（以0.5%CMC为混悬介质）的雄黄（As4S4或As2S2）。末次给药2h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肝脏和肾脏。称取0.3～0.4 g粉碎试样溶解于38 mL水、2 mL 3%乙酸溶液涡旋，60℃水浴超声2 h后静置5 min，4℃下，以9 000 r/min离心10 min，取上清液过0.2 μm滤膜后用HPLC-ICP-MS检测，结果AsB、DMA、AsIII、MMA、AsV检出限为0.3μg/L、0.3μg/L、0.3μg/L、0.5 μg/L、0.5 μg/L，线性范围为1～300μg/L，相关系数大于0.9990，加标回收率为83.8%～111.7%，相对标准偏差RSD＜5%（n=6）。对染毒大鼠肝、肾进行检测发现雄黄在大鼠肝脏代谢主要以DMA形式存在，并有少量的AsIII和未知物2；肾脏中的砷形态主要以DMA、MMA、AsIII、未知物1、未知物2和未知物3形式存在。

这类动物实验旨在探究砷形态在生物体内的代谢过程，对生物砷暴露之后的体内的代谢过程有更好的掌控，以便应用到对砷暴露人群进行更好的治疗。

4.3临床研究

砷化合物同时也是一种治疗用药物，研究人员发现砷可以有效治疗急性骨髓性白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）。

研究人员还对砷治疗的APL病人采取例如血液、尿液等生物检材来实时监控砷形态在APL病人体内的含量变化，以正确制定治疗方案。对于APL病人的相关研究：Yasuomi等［13］应用砷形态分析方法对APL病人进行日常0.08 mg/kg砒霜治疗35 d病情缓解后对其血浆、尿液（Days 4、5）进行分析，得到第四天24 h中AsIII、MMAV、DMAV血浆总含量为18 μg/L～41μg/L，尿液中总量为4 464 μg/d，获得治疗APL细胞仅需要血浆中有nM水平的砷就足够的结论。Baowei等［38］对9位进行砷治疗的APL患者的唾液进行HPLC-ICP-MS联用分析，发现唾液中占总砷含量71.8%的是AsIII，随着治疗进程，砷甲基化程度明显减少，表明在大剂量砷注射之后，甲基化进程趋向饱和。

通过APL患者的血液、尿液、唾液等生物检材实时监测病人体内砷形态代谢后含量变化，可以合理利用砷的医用价值，达到治疗APL的效果。

5　展望

生物样本中砷的形态分析对于研究砷的代谢机制、毒性评价、生物监测等方面研究具有重要意义。随着以形态为基础的毒理学的研究深入，金属形态分析将会越来越多的应用于法医学金属元素中毒案件。同时，随着研究人员对金属形态学领域认识的进一步深化，金属形态分析也将会越来越多地受到研究人员的关注。

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（本文编辑：卓先义）

Recent Progress in the Analysis of Arsenic Species in Biological Samples

LIN Lin1，SHEN Min2，MA Dong2
（1.College of Criminal Justice，East China University of Political Science and Law，Shanghai 200042，China；2. Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Shanghai Forensic Service Platform，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，P.R. China Shanghai 200063，China）

Abstract:Different species of arsenicals have different toxicity. The measurement and toxicity evaluation based on the total arsenic can not meet the requirement of scientific development. The toxicity，metabolism and measurement of different arsenic compounds have become international research hotspots in the fields of forensic toxicology，environmental protection，food safety，et al. This review summarized the research advance in the analysis of arsenic species in biological samples，including separation，identification and detection，in order to improve the understanding of the metabolism and toxicity of different arsenic species in organisms，as well as its application in forensic toxicology.

Key words:arsenic compound；speciation analysis；biological sample；pretreatment technique；analyzing technique；review

中图分类号:DF795.1

文献标志码:A

doi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.03.012

文章编号：1671-2072-（2016）03-0072-07

收稿日期：2016-01-07

基金项目：国家自然科学基金项目（81302613）；上海市技术标准专项（13DZ0503001）；中央级科研院所社会公益研究资助项目（GY1102）；上海市法医学重点实验室（14DZ2270800）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（16DZ2290900）

作者简介：林琳（1991—），女，硕士研究生，主要从事毒物分析研究。E-mail：idea00@yeah.net。

通信作者：马栋（1978—），男，副研究员，主要从事毒物分析研究。E-mail：modong@ssfjd.cn。