拉曼光谱技术在亚硝酸钠中毒快速检测中的研究

秦真科，曹芳琦，刘文斌，杨飞宇，郝红飞，孟航，2，张润生，2（.上海市刑事科学技术研究院上海市现场物证重点实验室，上海200083；2.上海市公安局物证鉴定中心，上海200083）



拉曼光谱技术在亚硝酸钠中毒快速检测中的研究

秦真科1，曹芳琦1，刘文斌1，杨飞宇1，郝红飞1，孟航1，2，张润生1，2
（1.上海市刑事科学技术研究院上海市现场物证重点实验室，上海200083；2.上海市公安局物证鉴定中心，上海200083）

摘要：目的对亚硝酸钠引起的血红蛋白结构变化进行研究，为亚硝酸钠中毒案件的快速、准确鉴定提供新的理论基础和技术储备。方法向全血中加入不同体积的同一浓度亚硝酸钠（NaNO2）溶液，研究分离提取的氧合血红蛋白（HbO2）及高铁血红蛋白（MetHb）的拉曼光谱及其结构与性能变化。结果通过血红蛋白拉曼谱峰中反映血红素平面和铁离子轴向配体键微小变形的400～700cm-1、与铁离子自旋态相关的1210～1230 cm-1和1500～1650 cm-1及与血红蛋白卟啉环反π*轨道上电荷浓度相关的1350～1380 cm-1处拉曼峰强度变化及峰位位移的信息，可以鉴别氧合血红蛋白和高铁血红蛋白。结论拉曼光谱技术在亚硝酸钠中毒的快速检测中具有较大优势，可为亚硝酸盐中毒鉴定提供重要判断依据。

关键词：氧合血红蛋白；高铁血红蛋白；拉曼光谱；亚硝酸钠中毒

亚硝酸钠（NaNO2）是白色至淡黄色粉末或颗粒状的一种无机盐，其外观及味道都与食盐相似，价格便宜，常在非法食品制作时用作食盐的不合理替代品。据统计，我国2005—2011年食物中毒案例中，亚硝酸钠中毒案件数位居前列［1］。

亚硝酸钠是强氧化剂，进入血液后可将亚铁血红蛋白（hemoglobin，Hb）氧化成高铁血红蛋白（methemoglobin，MetHb），即将血红蛋白的辅基血红素中Fe2+氧化成Fe3+，使整个血红蛋白分子的结构及化学键发生变化，失去载氧能力，造成机体组织缺氧而中毒［2］。进食含亚硝酸盐的食物后，短时间内皮肤、口唇黏膜、甲床就会出现紫绀，食入0.3～0.5g的亚硝酸盐即可引起中毒甚至死亡。

目前对于亚硝酸盐中毒的鉴定方法主要有三类：（1）化学分析法（包括联苯胺冰醋酸反应、安替比林反应、格利斯试剂反应），该类方法成本低、操作简便，可用于快速定性检测，但灵敏度较低，且亚硝酸盐在酸性条件下容易分解挥发，容易造成漏检［3］。（2）光度法，其中应用最广泛的是重氮耦合分光光度法，该方法成熟、准确度较高，但灵敏度一般，常用试剂存在致癌性，容易造成二次污染，当样品中亚硝酸盐含量较高时，紫红色偶氮化合物难以生成，会造成假阴性，而荧光光度法虽然能提高检测的灵敏度，但干扰因素大，条件不易控制，因而降低了检测的重现性［4-5］。（3）色谱法（包括气相色谱法、离子色谱法），该类方法准确度高、检出限低、定量线性范围宽，适合于各种生物基质中亚硝酸盐的微量甚至痕量分析，但前处理相对复杂，气相色谱法的前处理需要进行衍生化，增加了人为操作误差的风险［6］。

拉曼光谱作为分子结构鉴定的手段，能够反映待测分子的化学键及官能团信息，近年来在生物、医学、公共安全、有机化学等领域展现了较大的优势，特别适用于结构鉴定。拉曼光谱在血红蛋白结构研究及功能分析中具有无需标记、制样简单、无损检测和分析效率高等优越性［7-8］。本文用激光显微拉曼光谱仪分析了血液与亚硝酸钠反应后所引起的血红蛋白分子结构的变化，对氧合血红蛋白（HbO2）和高铁血红蛋白（MetHb）进行鉴定区分，进而为亚硝酸钠中毒鉴定提供一种新的快捷、简便、准确的方法。

1　材料与方法

1.1试剂及仪器

亚硝酸钠（NaNO2分析纯）、生理盐水、超纯水；高速冷冻离心机；点样玻璃毛细管；inVia Reflex激光显微拉曼光谱仪（英国Renishaw公司）。

1.2方法

1.2.1全血中血红蛋白的氧化反应

静脉抽取健康成人的血液4 mL于肝素锂抗凝管中，等分成4份，各1mL，标记1、2、3、4号样品。以生理盐水为溶剂，配置4mg/mL的NaNO2溶液10mL。1号样品作为空白参照，2号样品按照1:1体积比加入1mL的NaNO2溶液，3号样品按照1:2体积比加入2 mL的NaNO2溶液，4号样品按照1:4体积比加入4mL的NaNO2溶液，在室温下充分反应1h。

1.2.2全血中血红蛋白及高铁血红蛋白的分离制备

将四组样品分别以离心速率：3 000 r/min离心10min分离出红细胞，以生理盐水洗涤，再以同样的速率离心洗涤3次，分离出红细胞。再以1∶4体积比加入超纯水，在4℃温度下离心速率：1500r/min高速离心30min，分离提取反应后的血红蛋白。

1.2.3血红蛋白及高铁血红蛋白的检测分析

将四组样品分别进行拉曼光谱分析，光谱采集范围为400～1800 cm-1，每次光谱采集时间10 s，采集3次。

数据分析处理软件为Origin 8。

1.3方法优化

本次实验，分别采用三种激发波长：532、633、785 nm对分离提取的氧合血红蛋白和高铁血红蛋白进行检测，以期获得最优激发波长。

2　结果与讨论

2.1最优激发波长的选择

比较发现，532 nm激光激发的拉曼谱图效果最好，推测该波长下的拉曼峰以血红素的共振增强效应为主，而在633nm和785nm激光激发下，出现信噪比非常弱的拉曼峰，无法进行有效分析。

实验研究发现，激光功率越大，拉曼信号越强。然而，激光功率过强易导致蛋白质变性，无法测出血红蛋白明显的拉曼谱图。在用低功率激光强度下能够测出拉曼信号时，不建议提高激光功率进行测试，高功率激光在提高待测信号的同时，也提高了噪声信号。

2.2全血与不同体积比NaNO2反应后的颜色变化

亚硝酸盐中毒后，主要症状是高铁血红蛋白血症，表现为紫绀现象，先口唇、手指、脚趾青紫，然后全身皮肤青紫。在亚硝酸盐中毒致死案件中，尸斑呈蓝褐色，血液呈酱油色，不凝固。

本实验中，从外观颜色观察，全血与NaNO2氧化反应前后，全血颜色由红色变成紫褐色，且随着加入的NaNO2体积的增加，紫褐色越深。分析可能与血红蛋白的辅基血红素中Fe2+氧化成Fe3+并出现分子结构变化有关。该颜色变化，与实际亚硝酸盐中毒案件中紫绀现象基本一致［5］。

2.3全血与不同体积比NaNO2反应后血红蛋白的拉曼光谱

2.3.1血红蛋白与高铁血红蛋白的拉曼光谱及特征峰分析

全血和不同体积比的亚硝酸钠溶液反应前后，提取血红蛋白与高铁血红蛋白测其拉曼光谱（图1），拉曼位移及部分峰位归属见表1［9-11］。拉曼光谱峰位的归属分析可以得到官能团、化学键和电子密度等分子结构及其变化的信息。由于具有卟啉结构的血红素有较大拉曼散射截面，拉曼光谱可以很好的反映血红蛋白中血红素平面及其与铁离子轴向配体键的振动信息。血红蛋白拉曼光谱受血红素卟啉环中电子密度、卟啉环中心尺寸、铁离子与卟啉环平面的距离、铁离子自旋态等影响而变化。

图1　全血与NaNO2反应前后提取血红蛋白的拉曼光谱

表1　全血中加入不同体积比NaNO2的拉曼位移、特征峰及部分峰位归属

续表1

由图1可知，正常氧合血红蛋白在570、1357、1467 cm-1处有较明显的特征峰，高铁血红蛋白在495、1514 cm-1处有较明显的特征峰，570、1357、1467cm-1峰消失［12］。低频区400～700 cm-1反映血红素平面和铁离子轴向配体键的微小变形［13］。高频区（1200～1700 cm-1）反映血红素环骨架振动模式，由图2可知，该频段是血红素结构变化的敏感谱带。其中，1210～1230cm-1的拉曼光谱峰归属于次甲基变形模式，与自旋态相关；1370～1379 cm-1的拉曼光谱峰代表血红蛋白处在氧化态［14］，与血红蛋白卟啉环反π*轨道电荷浓度相关；1500～1650cm-1的拉曼光谱峰不仅对铁离子自旋态敏感，而且能够反映血红素中心与吡咯环N原子之间的距离，即卟啉环中心孔径大小卟啉环中心孔径大小每产生0.1nm的变化，对中心孔径大小敏感的特征峰将会产生5～6cm-1的移动，波数将随中心孔径的变小而增大［15］。

2.3.2血红蛋白与高铁血红蛋白的低频区拉曼光谱分析

在低频区，铁离子结合配体的不同将引起血红素电子分布的变化及卟啉环结构的变化。高铁血红蛋白在495cm-1出现新的特征峰，与Alian等发现的在500 cm-1处附近的特征峰结果一致［16］。血红蛋白特征峰570 cm-1代表了Fe-O2伸缩振动［12］，它的消失表明了铁氧键的断裂，氧合血红蛋白消失，氧化成高铁血红蛋白。随着NaNO2的加入，675cm-1峰向高波数方向移动，移至677cm-1处；755cm-1峰向高波数方向移动，移至757cm-1处；795cm-1峰向低波数方向移动，移至793cm-1处，是由于Fe2+被氧化成Fe3+，引起血红素卟啉环中电子浓度分布的改变所致［17］。

2.3.3血红蛋白与高铁血红蛋白的高频区拉曼光谱分析

在高频区，1350～1380 cm-1区域的谱线对应ν4振动模式，当卟啉环反π*轨道上电荷浓度增加时成键轨道能量变弱，引起拉曼频移，使ν4振动拉曼峰向低波数方向移动。其中，1356～1361cm-1区域的峰表示铁离子为处在低自旋态的亚铁离子Fe2+，随着NaNO2的加入，Fe2+被氧化成Fe3+，表征低自旋态的亚铁血红蛋白特征峰1357cm-1消失；1370～1379cm-1区域的峰表示处在氧化态的血红蛋白，1377 cm-1向低波数移动，分别移至1373 cm-1和1371cm-1处且强度减弱（图2），说明卟啉环反π*轨道电荷浓度增加，亚铁血红蛋白减少，高铁血红蛋白增加［9］。

图2　高频区部分拉曼峰的位移图谱

1210～1230 cm-1、1500～1650 cm-1区域的谱线对铁离子自旋态敏感［18］。随着NaNO2的加入，1223cm-1强度减弱较大。1549cm-1附近的峰向低波数方向移动，移至1546cm-1。1564cm-1峰向低波数方向移至高自旋态特征峰1562 cm-1处。1586 cm-1峰向低波数方向移至高自旋态特征峰1584 cm-1处，且强度减弱（图2）。

1500～1650 cm-1区域的谱线不仅对铁离子自旋态敏感，还能反映卟啉环中心孔径的大小。铁离子由低自旋态变成高自旋态，就远离卟啉环，使中心孔径变小，特征峰的波数也随之变大［15］。对卟啉环中心孔径大小敏感的特征峰1603 cm-1峰向高波数方向移动，移至1608 cm-1处，说明铁离子逐渐偏离卟啉环导致中心孔径变小，铁离子由低自旋态变为高自旋态，亚铁血红蛋白减少，高铁血红蛋白增加。1506 cm-1逐渐减弱并消失，1514 cm-1出现新峰，1620 cm-1处峰强迅速增加，同样表明高自旋态的Fe3+的增多（图2）。

2.3.4血红蛋白与高铁血红蛋白的拉曼谱峰强度变化

除了特征峰的出现及拉曼位移能够反映分子结构变化，拉曼峰的强度变化，也能很好的反应血红蛋白的结构变化。如血红蛋白在675 cm-1处有较强的峰，高铁血红蛋白在此处峰强减弱；血红蛋白在1564、1620 cm-1处有较微弱的峰，高铁血红蛋白在此处有较强的峰。

为了便于比较这三个峰的相对强度的变化，参照其相邻的强度变化不明显的拉曼峰，考虑两个相邻峰强度的相对变化，不考虑拉曼峰移，拉曼峰的相对强度同样能表现分子的化学键及官能团的变化信息，计算未有拉基线处理的原始数据（表2）。随着NaNO2的加入，I675/I755比值明显升高，I1549/I1564、I1603/ I1620比值明显降低，变化趋势如图3所示。随着加入NaNO2量的增加，比值呈现一定的递变规律。

图3　全血与不同体积NaNO2溶液反应后相邻拉曼峰的相对强度变化趋势

2.4体外实验样品存放时间对拉曼光谱的影响

亚硝酸盐中毒实际案件中，采集的样品往往并非新鲜血液，如血液存放时间较长、血液发生腐败等。本实验以1∶4体积比向新鲜全血中加入NaNO2溶液4mg/mL反应后，放置不同时间，进行拉曼光谱测试，以研究中毒不同时间后血红蛋白所发生的变化。分别研究在室温下充分反应1、6、24、48、72 h后高铁血红蛋白的拉曼光谱，实验发现，1、6 h拉曼光谱数据变化不大，推测以1∶4体积比向新鲜全血中加入NaNO2溶液4 mg/mL反应1h后，反应充分完成，血红蛋白几乎全部被氧化成高铁血红蛋白。但是，随着血液存放时间的延长，提取的血红蛋白的拉曼光谱信号逐渐减弱，471cm-1谱峰逐渐增强，产生原因可能和血红蛋白的变质变性有关，拉曼光谱如图4所示。拉曼光谱表明，血液存放时间较长，血红蛋白结构出现了较大变化，此时拉曼光谱技术在鉴定亚硝酸盐中毒方面，具有局限性。

表2　全血与不同体积NaNO2溶液反应后相邻拉曼峰的相对强度

图4　全血与不同体积NaNO2溶液反应并放置不同时间后的拉曼光谱

3　结论

本文基于拉曼光谱技术，研究了血红蛋白和高铁血红蛋白的特征拉曼峰，发现532 nm激光激发的拉曼光谱以血红素的共振增强效应为主，能较好的反映全血中血红蛋白氧化过程所发生的分子结构变化，血红素平面和铁离子轴向配体键微小变形的400～700cm-1、与铁离子自旋态相关的1210～1230cm-1和1500～1650cm-1及与血红蛋白卟啉环反π*轨道上电荷浓度相关的1350～1380 cm-1处拉曼峰强度变化及峰位位移的信息，可以鉴别氧合血红蛋白和高铁血红蛋白，为亚硝酸盐中毒案件的检验鉴定提供了重要依据。但样品存放时间过长，高铁血红蛋白的拉曼信号会逐渐变弱，推断和血红蛋白的变质变性有关，这给实际中毒案件的判定带来不确定性。

参考文献：

［1］聂艳，尹春，唐晓纯，等.1985-2011年我国食物中毒特点分析及应急对策研究［J］.食品科学，2013，34（5）: 218-222.

［2］Power G G，Bragg S L，Oshiro B T，et al. A Novel Method of Measuring Reduction of Nitrite-Induced Methemoglobin Applied to Fetal and Adult Blood of Humans and Sheep［J］. Journal of Applied Physiology，2007，103（4）: 1359-1365.

［3］苗翠英.毒物毒品检验［M］.北京:中国人民公安大学出版社，2013: 96.

［4］柏林洋，宋金海，冯刚.亚硝酸盐检测方法的研究进展［J］.广州化工，2011，39（13）: 31-33.

［5］廖林川.法医毒物分析［M］.北京:人民卫生出版社，2013:271.

［6］陈永平，林黎明，宫庆礼，等.亚硝酸盐和硝酸盐检测方法的研究进展［J］.分析试验室，2008，27（S1）:193-198.

［7］郭世珺，曾常春，李丽君，等.亚硝酸钠化高铁血红蛋白的拉曼光谱量化检测研究［J］.光谱学与光谱分析，2013，（7）: 1805-1809.

［8］Lu M，Zhao L，Wang Y，et al. Measurement of the Methemoglobin Concentration Using Raman Spectroscopy［J］. Artificial Cells，Nanomedicine，and Biotechnology，2014，42 （1）: 63-69.

［9］Wood B R，McNaughton D. Raman Excitation Wavelength Investigation of Single Red Blood Cells in Vivo［J］. Journal of Raman Spectroscopy，2002，33（7）: 517-523.

［10］Abe M，Kitagawa T，Kyogoku Y. Resonance Raman Spectra of Octaethylporphyrinato-Ni（II）and Meso-Deuterated and 15N Substituted Derivatives. II. A Normal Coordinate Analysis［J］. The Journal of Chemical Physics，1978，69 （10）: 4526-4534.

［11］Hu S，Smith K M，Spiro T G. Assignment of Protoheme Resonance Raman Spectrum by Heme Labeling in Myoglobin［J］. Journal of the American Chemical Society，1996，118（50）: 12638-12646.

［12］Jeyarajah S，Proniewicz L M，Bronder H，et al. Low Frequency Vibrational Modes of Oxygenated Myoglobin，Hemoglobins，and Modified Derivatives［J］. Journalof Biological Chemistry，1994，269（49）: 31047-31050.

［13］Rimai L，Salmeen I，Petering D H. Comparison of the Resonance Raman Spectra of Carbon Monoxy and Oxy Hemoglobin and Myoglobin. Similarities and Differences in Heme Electron Distribution［J］. Biochemistry，1975，14（2）: 378-382.

［14］Yamamoto T，Palmer G，Gill D，et al. The Valence and Spin State of Iron in Oxyhemoglobin as Inferred from Resonance Raman Spectroscopy［J］. Journal of Biological Chemistry，1973，248（14）: 5211-5213.

［15］Smulevich G. Understanding Heme Cavity Structure of Peroxidases: Comparison of Electronic Absorption and Resonance Raman Spectra with Crystallographic Results［J］. Biospectroscopy，1998，4（S5）: S3-S17.

［16］Desbois A，Lutz M，Banerjee R. Low-Frequency Vibrations in Resonance Raman Spectra of Horse Heart Myoglobin. Iron-Ligand and Iron-Nitrogen Vibrational Modes［J］. Biochemistry，1979，18（8）: 1510-1518.

［17］Podstawka E，Proniewicz L M. Resonance Raman Study of Deoxy and Ligated（O2and CO）Mesoheme IX-Reconstituted Myoglobin，Hemoglobin and its α and β Subunits［J］. Journal of Inorganic Biochemistry，2004，98（9）: 1502-1512.

［18］Wood B R，Caspers P，Puppels G J，et al. Resonance Raman Spectroscopy of Red Blood Cells Using Near-Infrared Laser Excitation［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，387（5）: 1691-1703.

（本文编辑：施妍）

Application of Raman Spectroscopy in the Rapid Detection of Sodium Nitrite Poisoning

QIN Zhen-ke1，CAO Fang-qi1，LIU Wen-bin1，YANG Fei-yu1，HAO Hong-fei1，MENG Hang1，2，ZHANG Run-sheng1，2
（1.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Institute of Criminal Science and Technology，Shanghai Municipal Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；2.Institute of Forensic Science，Shanghai Municipal Public Security Bureau，Shanghai 200083，China）

Abstract:Objective To investigate the structural change of oxyhemoglobin（HbO2）induced by sodium nitrite（NaNO2），and to establish a new method for the rapid identification of nitrite poisoning. Method Different volumes of sodium nitrite solution at the same concentration were added to the whole blood samples，and the hemoglobin was extracted and purified. Then the variations in the structure and properties of HbO2and methemoglobin（MetHb）were investigated with micro-Raman spectroscopy. Results The changes of intensity and location of Raman peaks at 400-700 cm-1，which is assigned to the iron-ligand modes，1210-1230 cm-1and 1500-1650 cm-1，which corresponds to the low spin state of iron，and 1350-1380 cm-1，which reflects the electron population in the porphyrin π* orbitals，can be used as indexes to detect HbO2and MetHb. Conclusion The Raman spectroscopy is of great potential in the rapid detection of nitrite poisoning in criminal cases.

Key words:oxyhemoglobin；methemoglobin；Raman spectroscopy；nitrite poisoning

中图分类号:DF795.1

文献标志码:A

doi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.03.007

文章编号：1671-2072-（2016）03-0044-06

收稿日期：2015-09-06

基金项目：上海市现场物证重点实验室资助项目（2014XCW ZZ04）；物证的初检技术（2014XCWZZ05）；公安部技术研究计划项目资助（2015JSYJB06）

作者简介：秦真科（1987—），男，助理研究员，主要从事物证光学探测及理化分析研究。E-mail: binhuzhen@163.com。

通信作者：张润生（1960—），男，研究员，主要从事毒品毒物的分析鉴定工作。E-mail:zhangrs0607@sina.com。