五味子乙素对BaP致HTR8-SVneo细胞损伤的保护作用及机制

吴念，陈亚琼，陈晓，侯海燕，王华



五味子乙素对BaP致HTR8-SVneo细胞损伤的保护作用及机制

吴念，陈亚琼，陈晓，侯海燕，王华

【摘要】目的：研究五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）预防苯并芘（BaP）致人绒毛膜外滋养层细胞（HTR8-SVneo）损伤的作用机制。方法：通过新型四唑化合物（MTS）法观察和测定，最终选取0.5，1，2 μmol/L Sch B分别作用HTR8-SVneo细胞24 h后再给予20 μmol/L Bap染毒处理24 h，MTS检测各组细胞生长情况；JC-1荧光染色法观察各组线粒体膜电位荧光强度变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组细胞内促凋亡蛋白（Bax）、细胞色素C （cytochromec，cyt-c）蛋白浓度；蛋白质印迹法（Western blotting）检测各组的凋亡蛋白（Caspase-9）。结果：①BaP染毒组OD值为1.187±0.015，0.5，1，2 μmol/L Sch B预保护24 h后的OD值分别为1.483±0.022、1.489±0.048和1.531±0.240，差异有统计学意义（P＜0.05）。②BaP染毒组线粒体荧光强度弱，0.5，1，2 μmol/L Sch B预保护24 h后的荧光强度较强，差异有统计学意义（P＜0.05）。③BaP染毒组Bax、cyt-c蛋白浓度升高，0.5，1，2 μmol/L Sch B预保护24 h后细胞内Bax、cyt-c蛋白浓度降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。④BaP染毒组细胞内caspase-9蛋白表达升高，0.5，1，2 μmol/L Sch B预保护24 h后细胞内caspase-9蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：Sch B可以预防BaP致HTR8-SVneo细胞损伤，其作用机制可能与抗线粒体途径有关。

【关键词】五味子乙素；苯并芘；人绒毛膜外滋养层细胞；线粒体；细胞色素C

作者单位：570203武警海南总队医院妇产科（吴念）；中国人民武装警察部队后勤学院附属医院妇产科（陈亚琼，陈晓，侯海燕，王华）

（J Int Obstet Gynecol，2016,43：45-48）

多环芳烃是常见的空气污染物，主要来自于烟草烟雾、煤炭燃烧、汽车尾气和烹调油烟，容易在水体、土壤和作物中残留蓄积[1]。苯并芘（BaP）是多环芳烃中最有代表性的污染物，有研究发现，BaP与不良妊娠结局有关，如流产、胎儿生长受限及畸形等，还和生育能力下降、不孕不育有关[2-3]，其可能的作用机制包括影响了细胞色素P450酶的代谢，参与氧化损伤、细胞凋亡及DNA损伤等[4-6]。五味子（北五味子）性酸味温，具有滋肾、止泻、敛肺、宁心、涩精、安神等功效，其主要成分Sch B不仅具有抗氧化抗凋亡功能[7-8]，还具有体外抑菌[8]、抗DNA损伤[9]等作用。Sch B可以降低某些药物的毒性和预防相关的疾病，如Sch B可以预防和治疗阿霉素诱导的急性心肌病[10]，削弱血管平滑肌细胞（VSMC）迁移和血管纤维化[11]，但Sch B在空气污染物致胚胎损伤的预防作用研究尚少见报道。本实验以HTR8-SVneo为载体，构建BaP损伤模型，探讨Sch B预防BaP致HTR8-SVneo细胞损伤的可能机制。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器胎牛血清、胰蛋白酶（Gibcol公司），RPMI-1640培养液（Gibcol公司）。Sch B（中国药品生物制品鉴定所），BaP（日本TCI公司）；新型四唑化合物（MTS，美国Promega公司），线粒体膜电位试剂盒（天津碧云天生物有限公司），RIPA裂解液（北京普利莱基因技术有限公司），cyt-c、Bax酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海拜沃公司），Caspase-9（Abcam公司），人绒毛膜外滋养层细胞HTR8-SVneo由加拿大Graham Professor惠赠。

1.2方法

1.2.1细胞培养将HTR8-SVneo细胞接种于用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的RPMI-1640的培养液于37℃，5%CO2培养箱培养，取对数生长期的细胞实验。

1.2.2MTS检测药物对细胞活性的影响取对数生长期的细胞104个/mL接种于96孔板内培养，分5组。对照组：不给予任何处理；BaP染毒组：BaP染毒24 h组；Sch B低剂量组：0.5 μmol/L Sch B（48 h）+20 μmol/L BaP（24 h）；Sch B中剂量组：1 μmol/L Sch B（48 h）+20 μmol/L BaP（24 h）；Sch B高剂量组：2 μmol/L Sch B（48 h）+20 μmol/L BaP（24 h）。先将MTS与培养基按照1∶5的比例配置好，吸弃96孔板培养基，每孔加入120 μL MTS溶液，并设有调零组，置于37℃、5%CO2温箱中培养2.5 h；然后用酶标仪检测波长490 nm条件下的光密度值（OD），实验重复3次。

1.2.3JC-1试剂盒检测线粒体膜电位细胞按105个/mL种植于6孔板，每组细胞处理同上，收集并用PBS溶液洗涤，按照线粒体膜电位试剂盒说明书，用配置好的JC-1染色工作液对细胞染色置于室温37℃孵育20 min，待孵育结束后吸弃上清，并用JC-1染色缓冲液洗涤2遍，再加入2 mL的细胞培养液，荧光显微镜观察拍照，IPP软件分析荧光强度，实验重复3次。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物发出强烈的红色荧光；当线粒体膜电位下降或丧失时，JC-1只能形成单体产生绿色荧光。因此可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量线粒体的去极化程度。

1.2.4ELISA检测细胞内cyt-c、Bax浓度cyt-c一般存在于线粒体内，当Bcl-2家族中的Bax升高时，cyt-c就会从线粒体中释放到胞浆中。细胞按105个/mL种植于6孔板，每组细胞处理同上，收集细胞，然后反复冻融，使细胞膜破坏并释放细胞内成分。严格按照ELISA试剂盒说明检测各组细胞内cyt-c、Bax的吸光度值，依靠标准曲线根据每个待测样品的OD值算出对应的蛋白浓度，实验重复3次。

1.2.5Western blotting检测各组的Caspase-9蛋白的表达细胞按105个/mL种植于6孔板，每组细胞处理同上，收集细胞，提取蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒测定各组的蛋白浓度，样品经SDS-PAGE电泳分离，湿转至硝酸纤维素膜，膜在室温下用封闭液封闭1 h，Caspase-9稀释抗体（1∶2 500）和βactin稀释抗体（1∶1 000），过夜，洗膜后加入封闭液稀释的二抗稀释液（1∶3 500），室温2 h。用ECL solution显色，最后进行显影，定影。实验重复3次。

1.3统计学方法SPSS 17.0统计软件处理实验数据，定量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两组间的比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组细胞的细胞活性和膜电位变化BaP染毒组细胞活性低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Sch B低、中、高剂量组细胞活性均高于BaP染毒组，差异有统计学意义（P＜0.01）。BaP染毒组线粒体荧光强度低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Sch B低、中、高剂量组均高于BaP染毒组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1和图1（见后插一）。

表1　各组HTR8-SVneo细胞内OD值及线粒体荧光强度（±s）

表1　各组HTR8-SVneo细胞内OD值及线粒体荧光强度（±s）

组别　n　OD值　线粒体荧光强度对照组①　3　1.568±0.012　10.213±2.366 BaP染毒组②　3　1.187±0.015*　3.347±0.855* t（P）　34.078（＜0.05）　4.728（＜0.05）SchB低剂量组③　3　1.483±0.022**　6.993±0.532** SchB中剂量组④　3　1.489±0.048**　7.150±1.216** SchB高剂量组⑤　3　1.531±0.240**　8.728±1.046** F（P）　84.714（0.000）　17.354（0.000）

2.2各组细胞内cyt-c、Bax蛋白浓度BaP染毒组Bax、cyt-c蛋白浓度高于对照组。Sch B低、中、高剂量组Bax蛋白浓度低于BaP染毒组，cyt-c均低于BaP染毒组（P＜0.01），差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2　各组HTR8-SVneo细胞内Bax及cyt-c蛋白浓度（±s）

表2　各组HTR8-SVneo细胞内Bax及cyt-c蛋白浓度（±s）

组别　n　Bax蛋白浓度　cyt-c蛋白浓度对照组①　3　166.342±0.368　1.741±0.229 BaP染毒组②　3　231.818±3.246*　2.317±0.036* t（P）　34.716（＜0.05）　4.318（＜0.05）Sch B低剂量组③　3　204.559±1.476**　2.068±0.097** Sch B中剂量组④　3　191.578±2.622**　1.863±0.062** Sch B高剂量组⑤　3　184.442±2.349**　1.802±0.071** F（P）　208.328（0.000）　33.204（0.000）

2.3各组细胞Caspase-9蛋白的表达BaP染毒组Caspase-9蛋白表达较对照组降低，Sch B低、中、高剂量组Caspase-9蛋白表达均高于BaP染毒组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2和表3。

图2　Western blotting法检测5组细胞中Caspase-9蛋白的表达

表3　各组HTR8-SVneo细胞中Caspase-9蛋白的表达

3　讨论

胚胎停育是自然流产的一种特殊类型，与妊娠中期流产不同，多在胚胎尚未形成的时候就停止了发育。造成胚胎停育的原因有很多，主要与精子问题、内分泌失调、免疫功能异常、生殖道感染、子宫异常和环境因素等有关，但仍有约50%的病因不明。目前已有研究证实胚胎停育可能与绒毛细胞有关，查斌斌等[12]通过体外实验证实绒毛细胞染色体异常是胚胎停育的主要原因。在众多影响因素中，环境空气污染问题与人类生存繁殖是密切相关的，因此环境因素对胚胎发育的影响越来越受到人们的重视。

有研究表明环境空气污染物与不良妊娠结局如早产、低出生体质量和宫内生长受限等有关。研究认为在胎儿生长的重要时期，空气污染物穿过胎盘对生长胎儿的分裂细胞造成不可挽回的损害，低氧损伤或免疫调节损伤是导致不良妊娠结局的可能机制，其中死胎的危险与早期妊娠周围二氧化氮和二氧化硫浓度以及妊娠后期二氧化硫和一氧化碳浓度的增加有关[13]。而在分娩前空气污染物浓度短期增加可能会触发死胎[14]。由此可见，在胚胎发育的初期，空气污染物对妊娠的不良结局有一定的影响。前期研究已经证实，胚胎停育的孕妇外周血BaP DNA加合物的浓度明显高于正常妊娠的孕妇，认为妊娠早期接触BaP是胚胎停育的危险因素[15]。此外，本研究还证实了Sch B对BaP致HTR8-SVneo细胞氧化损伤具有保护作用[16]，但Sch B是否可以通过其他作用途径预防损伤还有待进一步研究。有报道Sch B可以通过下调促凋亡蛋白基因降低Caspase-3的活性，发挥抗凋亡作用[17]；虽然近期对Sch B保护作用的相关研究很多，但Sch B对BaP致胚胎损伤的预防作用途径研究尚少见报道，因此笔者从Sch B抗凋亡作用进行初步探讨，试图解释Sch B对BaP致HTR8-SVneo细胞损伤的保护作用及机制研究。

生物体内的各种组织细胞通过增殖和凋亡来维持数量平衡，细胞凋亡的通路主要是死亡受体通路和线粒体通路。BaP与结合在线粒体外膜或存在于胞浆中的Bcl-2成员Bak、Bax等相互作用，导致后者寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体膜的通透性改变，跨膜电位丢失，从而释放出cyt-c。释放的cyt-c与凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic protease-activating factor-1，Apaf-1）及Caspase-9形成多聚复合体，并且使其自我剪切活化，再激活下游的Caspase家族，完成其相应底物的剪切，最终引起细胞凋亡[18]。本研究证实Sch B可以抗线粒体通路预防BaP致HTR8-SVneo细胞的损伤，通过降低细胞内Bax蛋白的浓度，进而抑制下游凋亡信号Caspase-9的激活，达到预防BaP致HTR8-SVneo细胞的损伤作用。研究从线粒体通路探讨了Sch B预防BaP致HTR8-SVneo细胞损伤的作用机制，对阐明中药抗多环芳香烃环境污染物生殖毒性和开发预防不良妊娠结局的天然药物提供了理论基础。

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[本文编辑李淑杰]

·短篇论著·

The Protection Effect and Mechanism of Schisandrin B on Extravillous Trophoblast Cell Line Damage Caused by BaP

WU Nian，CHEN Ya-qiong，CHEN Xiao，HOU Hai-yan，WANG Hua.Department of Obstetrics and Gynecology，Hainan Provincia Corps Hospital，Chinese People′s Armed Police Forces，Haikou 570203，China（WU Nian）；Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital，Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（CHEN Yaqiong，CHEN Xiao，HOU Hai-yan，WANG Hua）
Corresponding author：CHEN Ya-qiong，E-mail：chenyq82@gmail.com

【Abstract】Objective：To explore the protection mechanism of Schisandrin B on extravillous trophoblast cell line damage caused by BaP.Methods：After 0.5，1，2 μmol/L Sch B deal with human HTR8-SVneo cells 24 h，added 20 μmol/L Bap 24 h，using MTS measured cells growth.Used JC-1 fluorescent staining to measure the change of mitochondrial membrane potential in each group.Respectively used ELISA to measure the concentration of Bax and cyt-c protein in each group.Respectively used Western blotting to analyse the expression of caspase-9 in each group.Results：①MTS results showed that BaP alone cell OD was 1.187±0.015，0.5，1，2 μmol/L Sch B the role of OD was 1.483±0.022，1.489±0.048 and 1.531±0.240，compared with BaP alone group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.②JC-1 fluorescent staining results showed that BaP alone cell mitochondrial fluorescent intensity was lower and 0.5，1，2 μmol/L Sch B the role of mitochondrial fluorescent intensity was higer.Compared with BaP alone group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.③ELISA results showed that BaP alone cell the concentration of Bax，cyt-c protein were higher and 0.5，1，2 μmol/L Sch B the role of the concentration of Bax，cyt-c protein were lower，respectively.Compared with BaP alone group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.④Western blotting results showed that BaP alone cell the concentration of caspase-9 protein was higer，and 0.5，1，2 μmol/L Sch B the role of the concentration of caspase-9 protein was lower，respectively.Compared with BaP alone group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusions：Schisandrin B can prevent damage of extravillous trophoblast cell line caused by BaP，whose mechanism may be associated with resistance to mitochondrial pathway.

【Keywords】Schisandrin B；BaP；Extravillous trophoblast cell；Mitochondria；Cyt-cl

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81273977/H2902）；天津市自然科学基金一般项目（12JCYBJC16200）

通信作者：陈亚琼，E-mail：chenyq82@gmail.com

收稿日期：（2015-07-28）