胎盘胆盐输出泵蛋白的表达及其与妊娠期肝内胆汁淤积症的关系

顾丽萍，刘晓慧，宋晔，侯顺玉，戴建荣



胎盘胆盐输出泵蛋白的表达及其与妊娠期肝内胆汁淤积症的关系

顾丽萍，刘晓慧，宋晔，侯顺玉，戴建荣

【摘要】目的：探讨胎盘组织中胆盐输出泵（bile salt export pump，BSEP）的表达水平及其与妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）的关系。方法：选取2012年2月—2013年8月在苏州市立医院本部产科住院分娩的ICP孕妇30例作为研究组（ICP组），同期分娩的健康妊娠晚期孕妇30例作为对照组，采用免疫组化（SP）法和蛋白质印迹（western blotting）法测定2组孕妇胎盘组织中BSEP蛋白的表达。结果：BSEP蛋白表达于胎盘滋养细胞的细胞质中。ICP患者胎盘组织BSEP的表达低于正常胎盘组织，差异有统计学意义[（0.197 7±0.111 8）vs.（0.616 0±0.384 9），P＜0.001]。结论：BSEP蛋白在胎盘组织中表达的降低可能与ICP有关。

【关键词】胆汁淤积，肝内；妊娠；胎盘；胆汁酸类和盐类

作者单位：215002江苏省苏州市立医院本部妇产科

（J Int Obstet Gynecol，2016,43：42-44）

妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是妊娠期所特有的一种疾病，对围生儿威胁极大，可导致胎儿窘迫、早产、胎儿猝死[1]，患病围生儿病死率为1%～11%[2]。目前ICP的病因仍不十分明确，其发生与胆汁酸形成、转运和调节的生理机制密切相关，其中任一环节出现异常，均会发生肝内胆汁淤积。笔者临床发现，双卵双胎ICP孕妇一胎儿胎死宫内，剖宫产术中发现死胎的羊水污染，另一活胎的羊水性状正常，同为ICP的母体环境，但两胎儿的结局不同，故引发从胎盘角度探讨ICP的发病机制。人体内胆汁酸主要在肝细胞内由胆固醇转化而来，肝脏组织存在参与胆汁酸转运的多种载体，其中胆盐输出泵（bile salt export pump，BSEP）负责80%的胆盐由肝脏分泌入胆管。目前关于胎盘中是否存在与肝脏类似的胆盐转运载体的研究不多。本研究通过检测ICP患者胎盘中BSEP蛋白的表达，旨在探讨BSEP蛋白与ICP的关系。

1　对象与方法

1.1研究对象选取2012年2月—2013年8月在苏州市立医院本部产科住院分娩的ICP孕妇30例作为研究组（ICP组），同期分娩的健康妊娠晚期孕妇30例作为对照组。2组孕妇均无妊娠期高血压疾病、糖尿病、甲状腺疾病、肾脏病等妊娠合并症及并发症。2组孕妇年龄、孕周比较差异无统计学意义（P＞0.05），而ICP组血清总胆汁酸值（total bile acid，TBA）、产时羊水污染率均高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1　2组患者的年龄、孕周、母血TBA值和产时羊水胎粪污染情况的比较

1.2诊断和排除标准参照谢幸主编的妇产科学第8版[3]，ICP诊断标准为：①妊娠中晚期出现皮肤瘙痒，或伴黄疸；②母体血清TBA水平升高（＞10 μmol/L），或伴有肝功能障碍[天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）]障碍轻度至中度升高；③分娩后瘙痒症状消失，肝功能恢复正常。排除标准为：病毒性肝炎、肝胆石症、急性脂肪肝和HELLP综合征等。

1.3研究方法

1.3.1标本采集各种孕妇在胎盘娩出后15 min内避开出血、钙化灶，在直视下剪取胎盘母体面组织2块，每块大小约1 cm×1 cm×1 cm，用无菌生理盐水漂洗去除血液，其中一份放入冻存管中-80℃保存，一份置入4%多聚甲醛固定24 h后，常规脱水，石蜡包埋，连续切成4 μm厚的石蜡切片待用。

1.3.2主要试剂一抗为兔抗人BSEP单克隆抗体（美国Santa Cruz公司，货号SC-17292）；二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG（上海碧云天生物技术有限公司，货号A0201）；链霉素亲和素-生物素-酶复合物（SABC）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.3.3免疫组化SP法石蜡切片经过常规脱蜡、水化、封闭后，加入一抗（工作浓度为1∶100），4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，5 min/次，加入二抗37℃孵育15～30 min，加入SABC 37℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次，DAB显色5～10 min，PBS洗3次，5 min/次，苏木素复染2 min，自来水冲洗10～15 min，脱水吹干后树胶封片，200倍显微镜镜检观察染色结果。结果判定标准：胞质出现棕黄色或黄褐色颗粒者为BSEP蛋白阳性。

1.3.4蛋白质印迹（Western blotting）提取胎盘组织总蛋白，Bradford法进行定量，每泳道40 μg上样量经十二烷基磺酸钠-丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），再转移至硝酸纤维素膜，TBST封闭液室温下封闭1 h，加一抗（工作浓度为1∶1 000）4℃孵育过夜，用TBST在室温下脱色摇床上洗涤5 min×3次，加入二抗室温孵育30 min，用TBST在室温下脱色摇床上洗涤5 min×3次，ECL显影，将胶片进行扫描存档，用Alpha软件处理系统分析目标带的灰度值，将BSEP蛋白的条带灰度值与内参β肌动蛋白（β-actin）条带灰度值的比值作为BSEP蛋白的相对表达量。

1.4统计学方法采用SPSS13.0软件进行数据分析。定量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。定性资料用百分率表示，组间比较采用卡方检验。所有检验均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1胎盘组织中BSEP蛋白的表达部位免疫组化SP法检测显示，正常胎盘组织的细胞质中可见明显的棕褐色染色，BSEP蛋白呈阳性表达，见图1（见后插一）；而在ICP的胎盘组织中未见明显棕黄色或棕褐色染色，BSEP蛋白呈阴性表达，见图2（见后插一）。

2.22组胎盘组织中BSEP蛋白表达水平Western blotting法检测结果显示，ICP组胎盘组织中BSEP/ β-actin灰度值为0.197 7±0.111 8，而正常胎盘组织中BSEP/β-actin灰度值为0.616 0±0.384 9，ICP组胎盘组织中BSEP的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（t=5.717，P＜0.001），见图3。

图3　Western blotting法检测ICP组及对照组中BSEP蛋白的表达

3　讨论

3.1妊娠期胆汁酸的代谢胆汁酸主要在肝细胞内由胆固醇转化而来，肝脏组织存在参与胆汁酸转运的多种载体，包括钠-硫磺胆酸同向转运多肽（NTCP）、有机阴离子转运多肽超家族（OATPs）、BSEP、磷脂输出泵[由多药耐药蛋白3（multidrug resistance 3 protein，MDR3）介导]、氨基磷脂转运体（FIC1）、多药耐药相关蛋白（MRP）等，其中BSEP负责80%的胆盐由肝脏分泌入胆管[4]。

妊娠后胎儿和胎盘的存在使胆汁酸的代谢过程变得更复杂。胎儿肝脏在妊娠12周后就能生成胆汁酸，但因胎儿肠道功能尚不成熟，不能进行有效的肝肠循环，为防止胆汁酸在胎儿体内淤积，需通过胎盘将胆汁酸转入母体血液循环进行代谢排泄[4]。

3.2BSEP基因多态性可能与ICP的发病有关

BSEP基因也称为ABCB11基因，位于染色体2q24，编码的BSEP蛋白是胆盐主要的转运器[5]，属于ATP结合盒（ATP binding cassette）转运蛋白家族。Eloranta等[6]首次比较了57例ICP患者和115例健康孕妇的ABCB11基因，发现该基因的单核苷酸多态性与ICP发生相关。此后越来越多的研究表明，胆汁淤积性疾病的发生与BSEP基因变异有关[7-8]。

由于多数ICP患者的症状在分娩后缓解或消失，ICP相关的基因突变可能受其他因素的影响，对于胎盘组织中是否存在与肝脏类似的各种胆盐载体目前国内外研究甚少。

3.3胎盘BSEP蛋白的表达与ICP的相关性本研究发现，BSEP蛋白表达于滋养细胞的细胞质中，而ICP患者胎盘上BSEP的表达明显降低。BSEP表达的下降可能导致胎儿胆汁酸向母体的转运减少，导致胎儿体内胆汁淤积。研究发现，ICP患者的胎儿血浆胆汁酸水平较正常妊娠母亲的胎儿升高[9]。近年的一项大样本前瞻性研究表明ICP患者胆汁酸水平增高与围生儿结局密切相关，胆汁酸水平越高胎儿缺氧越严重，提示胎儿的不良结局可能与胎儿体内胆汁酸水平增高有关[10-11]。贺晶等[12]对16例ICP导致死胎的临床分析也支持上述观点。研究发现，高浓度胆汁酸有浓度依赖性血管收缩作用，可使胎盘血管收缩，血灌注减少，氧合血流量骤然下降，导致胎儿急性缺氧，潴留的胆汁酸还可通过细胞毒作用影响胎儿，导致缺氧、窒息，甚至死亡[4]。此外，胆汁酸还可引起心律失常[13]。

总之，目前ICP的病因及发病机制仍不十分清楚，其发生与胆汁酸形成、转运和调节的生理机制密切相关，BSEP是胆盐转运的最主要的蛋白之一，其在胎盘组织中表达的降低，可能引起ICP胎盘对胆汁酸的转运障碍、胎儿体内胆汁淤积，导致胎儿窘迫。进一步研究胎盘胆盐载体的种类和功能，可能有助于阐明ICP胎儿体内胆汁淤积以及围生儿不良结局的发生机制。

参考文献

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[12]贺晶，陈璐，梁琤.妊娠期肝内胆汁淤积症发生死胎的临床因素分析[J].中华妇产科杂志，2011，46（5）：333-337.

[13]Gorelik J，Shevchuk A，de Swiet M，et al.Comparison of the arrhythmogenic effects of tauro-and glycoconjugates of cholic acid in an in vitro study of rat cardiomyocytes[J].BJOG，2004，111（8）：867-870.

[本文编辑王昕]

Study on the Placental Expression of BSEP in Intrahepatic Cholestasis of Pregnancy

GU Li-ping，LIU Xiao-hui，SONG Ye，HOU Shun-yu，DAI Jian-rong.Department of Obstetrics and Gynecology，Suzhou Municipal Hospital，Suzhou 215002，Jiangsu Province，China
Corresponding author：DAI Jian-rong，E-mail：daijianrong3013@sina.com

【Abstract】Objective：To explore the expression of bile salt export pump（BSEP）in placenta tissue and its relationship with intrahepatic cholestasis of pregnancy（ICP）.Methods：The expression of BSEP in the placenta was detected by immunohistochemistry and western blotting respectively in 30 women with ICP（ICP group）and 30 normal gravidas（control group）from February 2012 to August 2013 in Department of Obstetrics of Suzhou Municipal Hospital.Results：BSEP was located at the cytoplasm in the placental trophoblastic cells.The expression of BSEP in ICP group was significantly lower than control group[（0.197 7±0.111 8）vs.（0.616 0±0.384 9），P＜0.001].Conclusions：Decreased expression of BSEP in placenta may be associated with ICP.

【Keywords】Cholestasis，intrahepatic；Pregnancy；Placenta；Bile acids and salts

基金项目：苏州市科教兴卫青年科技项目（KJXW2011023）

通信作者：戴建荣，E-mail：daijianrong3013@sina.com

收稿日期：（2015-07-05）