丙氨酰-谷氨酰胺治疗重症急性胰腺炎机制的实验研究

韩海燕，陈家秀，张立欣，傅 强

福建医科大学附属福州市第一医院干部病房，福建 福州 350009

丙氨酰-谷氨酰胺治疗重症急性胰腺炎机制的实验研究

韩海燕，陈家秀，张立欣，傅 强

福建医科大学附属福州市第一医院干部病房，福建 福州 350009

目的 研究肠内及肠外营养途径给予丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)大鼠肠道炎症反应及免疫功能变化的影响，探讨其作用机制。方法 以假手术组(20只)大鼠作为对照，将60只SAP组的大鼠随机分为4组：EN组、EN+Gln组、PN组、PN+Gln组。分别收集上述5组大鼠手术后1 h、5 h、10 h、24 h、48 h、72 h时间点的血清，采用ELISA法检测各时间点血清中淀粉酶(AMS)、热休克蛋白-70(HSP-70)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。72 h后处死大鼠，分别取上述5组大鼠回盲部肠管，ELISA法检测回肠内容物分泌型IgA(S-IgA)的含量，流式细胞法检测肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平。 结果 与对照组相比，SAP组大鼠血清AMS及HSP-70、TNF-α水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与EN组相比，EN+Gln组大鼠HSP-70、TNF-α水平更早下降，且下降明显，差异具有统计学意义(P<0.05)；与PN组相比，PN+Gln组大鼠HSP-70、TNF-α水平降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，SAP组大鼠肠内容物S-IgA含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，SAP组大鼠肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与EN组相比，EN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与PN组相比，PN+Gln组大鼠S-IgA含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SAP大鼠血清淀粉酶及HSP-70、TNF-α水平明显升高，HSP-70及TNF-α可能参与SAP的炎症反应；早期肠内营养添加Ala-Gln可以降低SAP大鼠HSP-70及TNF-α水平，可以提高肠道局部CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和巨噬细胞水平，增强肠道局部免疫反应，具有治疗SAP的作用。

重症急性胰腺炎；谷氨酰胺；肠道炎症反应；肠道免疫反应

谷氨酰胺(Gln)是一种由骨骼肌产生的氨基酸，参与体内多种代谢活动。当全身性炎症反应、大手术应激等时，骨骼肌产生的Gln无法满足机体对其的消耗，造成Gln缺乏，继而引起全身性感染甚至死亡，因此Gln目前被列为条件必需氨基酸之一[1-3]。由于Gln不稳定，常与丙氨酸结合制成稳定的Gln双肽，临床上有报道应用丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)治疗SAP，但具体机制尚未完全明了，本文拟通过动物实验研究Ala-Gln对SAP大鼠的热休克蛋白-70(HSP-70)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及肠道免疫功能的影响，探讨其可能的作用机制，并探讨其最佳的使用途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用福建医科大学实验动物中心的清洁级SD大鼠，体质量180～240 g，经适应性喂养24 h后用于实验。

1.2 实验动物分组 SD大鼠适应性喂养24 h，随机分为SAP组(60只)和对照组(20只)。SAP组又随机分为EN组、EN+Gln组、PN组、PN+Gln 组。

1.3 动物模型的制备 通过逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠溶液建立大鼠SAP模型，采用传统的Aho[4]逆行胰胆管注射法建立大鼠SAP模型。SAP大鼠术中将3.5%牛磺胆酸钠溶液用微量注射泵恒速注入胰胆管内，用量1 ml/kg，以0.2 ml/min的速度注射完毕；对照组大鼠术中使用生理盐水进行胰胆管灌注，剂量及方法同SAP组。EN组采取胃十二指肠置管方法进行肠内营养，PN组采取尾静脉留置插管方法进行肠外营养。对照组进行假手术后给予自由普通饮食。

1.4 营养制剂 EN营养制剂组分为：水、麦芽糊精、酪蛋白、植物油、膳食纤维(大豆多糖等)、矿物质、维生素和微量元素等。每100 ml提供总能量100 kal，碳水化合物、蛋白质、脂肪供能比为61∶20∶19。PN营养制剂：采用50%葡萄糖、20%复方氨基酸和20%脂肪乳剂作为基本营养成分，每100 ml提供总能量100 kal，碳水化合物、蛋白质、脂肪供能比为56∶19∶25。Gln制剂：EN+Gln组及PN+Gln组动物每天肠内及肠外营养液中添加0.4 g/kg纯度为98%的Ala-Gln双肽(力肽注射剂，华瑞公司产品)。所有实验动物可自由饮水。营养制剂的剂量为每天250 ml/kg，麻醉苏醒后2 h开始输注营养液，第1天输半量，第2天开始输全量。各组营养液当天配制，用微量注射器泵在24 h内均匀输注。

1.5 实验方法

1.5.1 血清AMS、HSP-70及TNF-α含量的测定：分别收集上述5组大鼠手术后1 h、5 h、10 h、24 h、48 h、72 h时间点的血清，按说明书采用ELISA法检测各时间点血清中淀粉酶(AMS)、HSP-70、TNF-α的水平。ELISA试剂盒购自上海蓝基科技有限公司。

1.5.2 肠内容物S-IgA含量：取盲肠内容物，加入4 ml生理盐水，4 ℃冰箱震荡过夜，4 000 r/min离心10 min，取上清液按ELISA试剂盒(购自上海蓝基生物科技有限公司)操作方法检测。

1.5.3 肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞检测：在大鼠小肠的近端空肠5 cm以下处取2 cm 长的空肠(回盲部肠管)，匀浆后，4 ℃条件下，准确称量0.3 g肠组织，剪碎，移入玻璃匀浆器，然后加入预冷的生理盐水至总体积3 ml，在冰浴中用玻璃匀浆器仔细研磨，制备10%肠组织匀浆。将匀浆液低温离心(4 ℃，3 500 r/min)10 min，取上清液，使用流式细胞仪(美国贝克曼公司的COULTER®DNA PREPTMReagents Kit)测定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分比及CD68+巨噬细胞的百分比。

2 结果

2.1 SAP组和对照组大鼠不同时间点血清中AMS、HSP-70及TNF-α的水平 SAP组大鼠血清AMS水平在术后1 h开始升高，术后10 h达峰值，术后24 h开始下降，对照组大鼠血清淀粉酶水平无明显变化(见图1)。SAP组及对照组大鼠血清HSP-70及TNF-α水平均于术后1 h开始升高，术后5 h达峰值，与对照组相比，SAP大鼠升高更明显，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1)。SAP组大鼠血清HSP-70及TNF-α水平持续时间更久，术后24 h开始下降，对照组术后10 h开始下降(见图2、图3)。

2.2 EN组内SAP大鼠不同时间点血清HSP-70及TNF-α的水平 EN组SAP大鼠术后10 h血清HSP-70、TNF-α水平开始下降，EN+Gln组SAP大鼠HSP-70、TNF-α水平也术后10 h开始下降，EN+Gln组下降更明显，两组大鼠下降的幅度差异具有统计学意义(P<0.05)(见图4、图5)。

2.3 PN组内SAP大鼠不同时间点血清HSP-70及TNF-α的水平 两组SAP大鼠血清HSP-70、TNF-α水平均于术后10 h开始下降，与PN组SAP大鼠相比，PN+Gln组SAP大鼠下降的幅度更明显，但差异无统计学意义(P>0.05)(见图6、图7)。

2.4 SAP组和对照组大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布 与对照组相比，SAP组大鼠肠内容物S-IgA的含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，SAP组大鼠肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05，见表1)。

注：各组横坐标中1～6代表术后1 h、术后5 h、术后10 h、术后24 h、术后48 h、术后72 h。

图1 两组大鼠术后不同时间点的AMS浓度; 图2 两组大鼠术后不同时间点的HSP-70浓度； 图3 两组大鼠术后不同时间点的TNF-α浓度; 图4 EN及EN+Gln组大鼠术后各时间点的HSP-70浓度；图5 EN及EN+Gln组大鼠术后各时间点的TNF-α浓度;图6 PN及PN+Gln组大鼠术后各时间点的HSP-70浓度；图7 PN及PN+Gln组大鼠术后各时间点的TNF-α浓度

Fig 1 The differences of AMS between two groups of rats at different time points after surgery; Fig 2 The differences of HSP-70 between two groups of rats at different time points after surgery; Fig 3 The differences of TNF-α between two groups of rats at different time points after surgery; Fig 4 The differences of HSP-70 between EN group and EN+Gln group of rats at different time points after surgery; Fig 5 The differences of TNF-α between EN group and EN+Gln group of rats at different time points after surgery; Fig 6 The differences of HSP-70 between PN group and PN+Gln group of rats at different time points after surgery; Fig 7 The differences of TNF-α between PN group and PN+Gln group of rats at different time points after surgery

S⁃IgA含量(mg/ml)CD3+T淋巴细胞(%)CD4+T淋巴细胞(%)CD8+T淋巴细胞(%)CD68+巨噬细胞(%)SAP组0．663±0．16730．124±5．24237．492±6．78116．498±5．64826．359±6．875对照组1．915±0．34839．258±7．85448．472±8．56424．125±5．24635．746±7．215F值969．562123．39172．8174．473144．48P值<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

2.5 EN组及PN组SAP大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布 与EN组相比，EN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差异具有统计学意义(F=98.305、111.37、23.158、89.848、86.895，P均<0.001)；与PN组相比，PN+Gln组大鼠S-IgA含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差异无统计学意义(F=0.039、3.052、2.346、2.461、0.625，P值依次为0.846、0.098、0.143、0.134、0.44，见表2)。

S⁃IgA含量(mg/ml)CD3+T淋巴细胞(%)CD4+T淋巴细胞(%)CD8+T淋巴细胞(%)CD68+巨噬细胞(%)EN组0．695±0．26530．154±5．39739．193±7．23516．269±5．26725．398±5．147EN+Gln组2．034±0．684∗42．531±6．186∗49．127±9．487∗26．481±4．288∗33．157±6．589∗PN组0．852±0．84131．184±7．97337．149±9．14618．532±6．21729．345±7．658PN+Gln组0．966±0．71233．129±10．59742．421±7．98422．174±5．18932．985±7．614

注：与EN组比较，*P<0.001。

3 讨论

SAP是临床上常见的危重疾病，死亡率高，但其确切的发病机制目前尚未完全明了。传统的观点认为急性胰腺炎是由胰酶“自身消化”所致，但缺乏临床证据。目前认为，炎症介质在急性胰腺炎发病中发挥重要作用。HSP-70是分子量约70 kD的热休克蛋白，是热休克蛋白家族中重要的一员，被称为主要热休克蛋白，包括分子量为68、72、73、75、78 kD等20多种蛋白。在正常生理条件下，如细胞的增生和分化、胚胎的生长和发育、激素的刺激等，热休克蛋白即呈基础表达。正常生长条件下，所有细胞中，热休克蛋白占总蛋白量的5%～10%。在应激条件下热休克蛋白表达明显增加，且可发生移位。TNF-α是败血症和多器官衰竭的早期炎症介质。本实验发现，与对照组相比，SAP组大鼠血清HSP-70及TNF-α水平更早升高，且持续时间更久，差异有统计学意义。提示促炎细胞因子HSP-70及TNF-α在SAP发病过程中发挥重要作用。

Gln是人体最多的游离氨基酸之一，在生理情况下是非必需氨基酸。在某些危重疾病，如急性胰腺炎时,Gln明显缺乏，具体的机制目前尚未完全明了。原因可能为Gln是小肠的主要能量来源，是维持肠道免疫功能的重要氨基酸,也是核酸生物合成所必需的原料，而在分解代谢状态下和严重应激时，利用Gln的组织及细胞,如肠黏膜和受刺激的免疫细胞对Gln需要迅速增加,超过体内合成造成Gln相对缺乏。在SAP时,肠道Gln消耗明显增加，Gln利用率也明显下降，可能会降低细胞增殖率,进而影响肠道细胞分化和黏膜细胞更新。在SAP病程进展中，Gln缺乏将导致肠道细菌易位，免疫功能紊乱。近20年动物实验和临床实验都表明Gln有促进氮平衡,保持肠黏膜完整，防止细菌易位和肠毒素入血,增加肠免疫和全身免疫等诸多特殊功效，但其对炎症因子的影响研究较少。本实验中，肠内营养或肠外营养中添加Ala-Gln的SAP大鼠HSP-70及TNF-α水平均明显降低，提示Gln可能通过抑制促炎症因子的水平发挥抗SAP作用。而与单纯肠内营养组相比，添加Ala-Gln的SAP大鼠HSP-70及TNF-α水平下降差异具有统计学意义，肠外营养添加Ala-Gln的SAP大鼠HSP-70及TNF-α水平下降差异无统计学意义，提示添加Gln的保护型EN具有明显的抗炎性作用，疗效优于肠外营养。

如何保护肠道功能屏障是治疗SAP的首要任务，而肠道免疫功能屏障是肠道功能屏障的重要组成部分，其在保护SAP肠道功能屏障中的作用日益突出。大量实验结果[5-6]表明，SAP时Gln明显缺乏，补充Gln具有治疗SAP的作用，而目前Gln对SAP是否具有保护肠道免疫功能屏障的作用研究较少。

肠道免疫屏障由肠上皮细胞(intestinalepithelial cell, iEC)、肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocyte, iIEL)、 固有层淋巴细胞(lamina proprial lymphocyte, LPL)、派伊氏结(peyer patch, PP)和肠系膜淋巴结等肠道组织及肠道浆细胞S-IgA构成[7]，其主要功能是由相关淋巴样组织通过S-IgA发挥抗感染的体液免疫及细胞毒性的细胞免疫。

本研究结果表明，与对照组相比，SAP组大鼠肠内容物细菌S-IgA的含量、肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，说明SAP时肠道免疫功能屏障明显受损。由于Gln不稳定，常与丙氨酸结合制成稳定的Gln双肽。本实验中，分别应用肠内营养及肠外营养两种不同途径添加Gln。结果显示，与EN组相比，EN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差异具有统计学意义；与PN组相比，PN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差异无统计学意义。说明肠内营养添加Gln具有明显提高肠道局部体液免疫及细胞免疫，保护肠道免疫功能屏障，从而达到治疗SAP的作用。

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(责任编辑：李 健)

The protective effect and mechanism of alanyl-glutamine dipeptide in treatment of severe acute pancreatitis

HAN Haiyan, CHEN Jiaxiu, ZHANG Lixin, FU Qiang

Cadre Ward, Fuzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350009, China

Objective To investigate the protective effect and mechanism of alanyl-glutamine dipeptide(Ala-Gln) in treatment of severe acute pancreatitis (SAP) in rats．Methods Eighty rats were divided into control group (20 rats) and SAP groups (60 rats) which were randomly divided into 4 groups (enteral nutrition with/without Ala-Gln & parenteral nutrition with/without Ala-Gln groups)．The levels of amylase (AMS), heat shock protein-70 (HSP-70) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum at different time points and the levels of secrete-IgA (S-IgA) and CD3+, CD4+, CD8+CD68+T cells in ileocecus intestine were measured in different groups.Results Compared with control group, the levels of AMS, HSP-70 and TNF-α were significantly increased in SAP groups (P<0.05)．The levels of HSP-70 and TNF-α were significantly declined in EN+Gln group compared with EN group (P<0.05). Meanwhile, the level of secrete-IgA (S-IgA) was significantly declined and the levels of CD3+, CD4+, CD8+CD68+T cells in ileocecus intestine were significantly increased in EN+Gln group compared with EN group (P<0.001).Conclusion Ala-Gln may protect SAP rats by increasing intestinal immune response and declining its inflammatory reaction. Enteral nutrition with Ala-Gln may be the best way to treat SAP.

Severe acute pancreatitis; Glutamine; Intestinal inflammatory reaction; Intestinal immune response

2014年福建省科技项目计划(2014D030)；2013年福州市科技局科技计划项目(2013-S-122-2)

韩海燕，硕士研究生，主治医师，研究方向：胰腺疾病。E-mail：hhy1752@hotmail.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.08.015

论著·胰腺疾病

R576

A

1006-5709(2016)08-0892-04

2015-09-28