犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析

唐井玉，李传峰，宫晓华，李琦,3，丁明洋,3，陈宗艳，王桂军，刘光清

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥230036；3.甘肃农业大学，兰州730070）



犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析

唐井玉1,2，李传峰1，宫晓华1,2，李琦1,3，丁明洋1,3，陈宗艳1，王桂军2，刘光清1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥230036；3.甘肃农业大学，兰州730070）

摘 要：根据犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV） SH14株基因序列设计引物，采用PCR方法扩增CPV VP2基因，经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后，将其克隆至pGEX-4T-1载体，构建重组表达载体pGEX-4T-VP2，经酶切鉴定和测序验证正确后转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达，应用SDS-PAGE法检测蛋白的表达。然后，使用纯化的重组VP2蛋白制备其兔源多克隆抗体，分别应用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光检测该抗体的免疫原性。结果表明，pGEX-4T-VP2能在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达，所制备的兔抗CPV-VP2抗体能与重组蛋白和病毒蛋白发生特异性反应。本研究为研发CPV亚单位疫苗、检测技术及致病机理研究等奠定了物质基础。

关键词：犬细小病毒；VP2基因；原核表达；免疫原性

犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）属于细小病毒科，细小病毒属，该病毒属还包括猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV）、水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus，MEV）、猪细小病毒（Poecine parvovirus，PPV）、鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）等，它们之间的相似性高达90%[1]。CPV是感染犬的重要病原之一，各种犬均能被感染，主要危害幼犬，特别是2月龄至6月龄幼犬。主要表现为急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎，传播速度快，发病率和死亡率高[2]。该病毒于1978年在美国首次发现，随后在加拿大、法国、日本、澳大利亚均有报道[3]。我国于1982年最早报道了类似CPV所致的犬出血性肠炎[4]。CPV传染性强，发病率和病死率高，给我国养犬业带来了严重的威胁。

CPV为单股、负链线性DNA病毒，无囊膜，基因组全长5.3 kb，主要包含两个结构蛋白VP1和VP2，两个非结构蛋白NS1和NS2，分别由开放阅读框ORF1和ORF2编码[5,6]。VP2是CPV的免疫原性蛋白，编码CPV的主要抗原决定簇[7]，其N端及其蛋白转角结构区loop1和loop3是重要的B细胞抗原表位区，可诱导产生中和抗体[6,8]。VP2基因全长1755 bp，编码584个氨基酸，VP2上几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性和宿主范围[9]。随着VP2蛋白的研究逐步深入，对CPV感染机制和控制病毒的传播起到重要的作用。

本研究采用原核表达系统表达CPV VP2蛋白，纯化后重组蛋白具有良好反应原性，可为CPV单克隆抗体的制备奠定基础，制备的兔抗VP2抗体具有良好的特异性，为后续试验中CPV的检测及致病机制研究奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料 原核表达载体pGEX-4T-1、CPV SH14株由中国农业科学院上海兽医研究所保存；大肠杆菌菌株BL21和Trans5α菌株购自北京全式金生物技术有限公司；限制性核酸内切酶BamHΙ、XhoΙ、LA Taq premix 为TAKARA公司产品；DNA胶回收试剂盒和质粒小剂量提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；FITC标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗兔IgG均为康为世纪公司产品；DAB染色试剂盒为博士德公司产品。蛋白定量试剂盒为碧云天公司产品。其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2引物设计与目的基因扩增 根据SH14株基因序列，利用Primer 5.0软件设计一对特异性引物。上游引物：5'-ACTGGATCCATGAGTGATGGAGCAGT TCAAC-3'（下划线为Bam HⅠ酶切位点）；下游引物：5'-CCGCTCGAGGTATAATTTTCTAGGTGCTA GTTGA-3'（下划线为XhoⅠ酶切位点）。PCR产物预计大小约为1770bp。引物由Invitrogen公司合成。以CPV SH14株DNA为模板，PCR扩增目的基因，PCR扩增体系50 μL：LA Taq premix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/mL）2 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 16 μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。

1.3重组原核表达质粒pGEX-4T-VP2的构建 将PCR产物用胶回收试剂盒纯化目的片段。纯化后的PCR产物经Bam HⅠ、XhoⅠ双酶切后进行胶回收，再与经Bam HⅠ、XhoⅠ双酶切后的pGEX-4T-1载体片段经T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化至Trans 5α感受态细胞中，重组质粒经PCR和双酶切鉴定正确后送至上海华津生物科技有限公司测序，将测序正确的重组质粒命名为pGEX-4T-VP2。

1.4重组原核表达质粒pGEX-4T-VP2的表达 将构建好的重组原核表达质粒pGEX-4T-VP2转化至BL21感受态细胞中，挑取单克隆接种于含有100mg/mL氨苄青霉素（Amp+）的5 mL LB培养基中，37℃ 220 r/min过夜震荡培养，取过夜的菌液按1:100比例接种于新鲜10mL LB培养基，37℃ 220r/min震荡培养2～3h，待菌液浓度达OD600=1.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导4 h后取1 mL菌液离心收集菌体，加入10μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液、40 μL ddH2O悬浮菌体，100℃金属浴10 min后离心取上清进行SDS-PAGE。

1.5表达产物的纯化与定量 收集菌体后加入超声裂解缓冲液重新悬浮菌体沉淀，加入TE（PH=8.0）新鲜配制的溶菌酶，使其终浓度为1 mg/mL，37℃振荡培养30 min。置-20℃反复冻融3次后，超声裂解（工作1 s间歇3 s）10 min，将破碎后菌液反复冻融3次，10 800×g离心20 min，弃上清。用5 mL包涵体洗液Ⅰ（2 mol/L尿素、0.1%triton100、50mmolNaCl、0.2 mmol EDTA、PBS）将沉淀吹匀洗涤包涵体，5000×g离心20 min，弃上清，重复2次。用5 mL包涵体洗液Ⅱ（2 mol/L尿素、0.1%triton、PBS）洗2次，离心弃上清。用8 mol/L尿素4℃过夜溶解沉淀，10 800×g离心10 min，吸取上清加入透析袋中，分别用不同浓度尿素（6、4、2、1、0 mol/L）透析液梯度透析，每4 h换液一次。透析后液体5000×g离心10 min，上清存于-80℃。并用蛋白定量试剂盒测定其浓度。

1.6兔抗CPV-多克隆抗体的制备 将纯化好的VP2蛋白免疫新西兰大白兔。每次免疫1mg蛋白，首免蛋白和弗氏完全佐剂1:1混合后免疫，两免和三免蛋白与弗氏不完全佐剂1:1混合后免疫，四免直接免疫纯蛋白，每次免疫间隔2 w。四免后1 w心脏采血致死，分离血清。

1.7间接免疫荧光试验（indirect immunofl uorescece，IFA） 将接种CPV48 h后的CRFK细胞用4%多聚甲醛固定，4℃过夜封闭，用制备的VP2蛋白多克隆抗体为一抗，室温孵育2 h后，加入FITC标记的羊抗兔二抗室温孵育1 h，荧光显微镜下观察。同时设未感染CPV的CRFK细胞为阴性对照。

1.8Western blot 将纯化后的表达产物进行SDSPAGE电泳后，采用半干法转印至NC膜，10V，30 min，取出转印膜用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入1:200VP2多克隆抗体血清，室温孵育2 h，加入1:10000稀释的羊抗兔-HRP二抗，室温孵育1 h后DAB显色。

2　结果

2.1VP2基因扩增和重组质粒pGEX-4T-VP2 按照上述方法进行VP2鉴定基因扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见1770bp目的条带（图1a）。

该基因片段与pGEX-4T-1载体的重组质粒pGEX-4T-VP2用Bam HⅠ、XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果如图1b所示，双酶切后出现2条特异性条带，分别为1770 bp左右和4900 bp左右，pGEX-4T-1空载体则为单一条带。表明目的基因已插入相应的克隆位点，测序结果进一步证实载体构建成功。

图1　VP2基因扩增结果及重组质粒pGEX-4T-VP2双酶切结果Fig. 1 Amplifi cation of CDV VP2 gene and restriction analysis of recombinant plasmid pGEX-4T-VP2M: DNA分子质量标准2k plusⅡ; 1: VP2基因; 2: 阴性对照; 3: pGEX-4T-1双酶切; 4: pGEX-4T-VP2重组质粒双酶M: DNA Marker 2k plusⅡ; 1: VP2 gene; 2: Negative control; 3: Restriction enzymes digestion of pGEX-4T-1; 4: Restriction enzymes digestion of pGEX-4T-VP2

2.2重组原核表达质粒pGEX-4T-VP2的表达和纯化重组表达载体转化至BL21，经IPTG诱导4 h时进行SDS-PAGE分析，在90 kDa处有明显的诱导表达条带，其相对分子质量与预期一致。空载体转化菌经诱导后在26 kDa处可表达GST标签蛋白（图2a）。

图2　VP2重组蛋白的SDS-PAGE分析及GST-VP2重组蛋白纯化Fig. 2 SDA-PAGE analysis on VP2 recombinant protein and purifi ed of GST- VP2 recombinant proteinM: 蛋白质标准分子量; 1: 未诱导的空质粒重组菌; 2: 诱导的空质粒菌体; 3: 未诱导的重组菌; 4: 诱导的重组菌; 5: 纯化后的VP2重组蛋白M: Prestained protein marker; 1: pGEX-4T-1plasmid non-induced by IPTG; 2: pGEX-4T-1 plasmid induced by IPTG; 3: pGEX-4T-VP2 non-induced by IPTG; 4: pGEX-4T-VP2 induced by IPTG; 5: Purifi ed VP2 recombinant protein

对重组蛋白进行纯化，纯化后得到一条90 kDa的条带，与预期结果相符（图2b）。用碧云天公司蛋白定量试剂盒定量分析得到GST-VP2融合蛋白浓度为1.5 mg/mL。 2.4 间接免疫荧光试验（IFA） CRFK细胞接种CPV 48 h后，用IFA检测抗原的表达情况。结果显示，在荧光显微镜下可观察出现特异性荧光（图3a），阴性对照组无荧光（图3b），说明所制备的多克隆抗体具有较好的免疫原性。

图3　间接免疫荧光试验检测CPV感染CRFK细胞的结果Fig. 3 Detection result s of CRFK cell with IFAa: 接种CPV的CRFK细胞; b: 未接种CPV的CRFK细胞a: CRFK cell of post infection; b: Normal CRFK cell

2.5重组蛋白的免疫原性检测 以制备的多抗为一抗，对纯化后的重组VP2蛋白进行Western blot 检测，结果如图4所示，在目的蛋白大小处出现条带，表明本试验中表达的重组VP2蛋白具有良好的免疫原性。

图4　VP2多抗Western blot鉴定结果Fig. 4 Western blot result of VP2 polyclonal antibodyM: 预染的蛋白标准分子量; 1: VP2蛋白M: Prestained protein Marker; 1: VP2 recombinant protein

3　讨论

目前，犬细小病毒防治手段主要为疫苗免疫，用于预防犬细小病毒的疫苗主要有异源灭活苗、异源弱毒苗、同源灭活苗和同源弱毒苗4大类，使得CPV引起的犬的发病得到了缓和。但CPV近年来变异较快，VP2蛋白第300位氨基酸残基出现突变频率最高并且该位点可以导致CPV抗原性发生改变[10]，而且由于CPV灭活苗和弱毒苗存在各种不足，以及免疫犬仍发病的情况时常发生，CPV仍是引起犬死亡的主要病源之一。

CPV从出现到现在30多年的时间里，不断变化，至今已发现CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)和CPV-2c等基因型[11]，由于基因型众多，目前对CPV各毒株之间的地理分布、流行特征等方面尚不清楚。因此我国学者对此进行了大量的研究。Lope T JA等[12]在昆虫杆状病毒表达系统中表达了CPV VP2蛋白。10μg的表达蛋白可使犬获得良好的免疫效果；Langeveld等[13]合成的位于VP2氨基酸端21个氨基酸内有部分重叠两段多肽，分别免疫犬，均能产生免疫保护作用；杨德威等[14]将CPV PIREsneo/ VP2基因DNA疫苗免疫犬，可激发免疫力而没有致病性；杨玲[15]用大肠埃希氏菌系统成功表达了CPV VP2基因，其表达产物能诱导机体产生中和抗体。因此VP2蛋白对研究CPV疫苗具有重要意义。目前CPV基因工程疫苗研究以VP2蛋白为主，该蛋白能在一定程度上抵抗CPV的攻击。

目前有不同的载体在原核、真核系统中可以有效进行蛋白表达，本研究采用大肠杆菌为宿主的原核表达系统，具有繁殖快、成本低等优点[16]。由于大肠杆菌表达菌株BL21转化效率相对较低，本试验先把目的基因与载体连接产物克隆至Trans5α克隆菌株中，筛选出重组质粒后再转化至表达菌株，最后成功表达VP2蛋白。对表达产物可溶性分析，表达的VP2蛋白以包涵体形式存在于菌体裂解后的沉淀中。GST可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高VP2蛋白表达量作用[17]，而且GST标签方便纯化和切除。

本试验表达的蛋白表达量高、具有良好的免疫活性，有望为CPV诊断试剂的研制及亚单位疫苗的研发及ELISA方法的建立提供标准抗原；制备的多克隆抗体具有良好的特异性，且抗体水平较高，为后续CPV的研究奠定了基础。

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·研究论文·

PROKARYOTIC EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF VP2 OF CANINE PARVOVIRUS SH14 STRAIN

TANG Jing-yu1,2, LI Chuan-feng1, GONG Xiao-hua1,2, LI Qi1,3, DING Ming-yang1,3, CHEN Zong-yan1, WANG Gui-jun2, LIU Guang-qing1

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai, 200241 China; 2. College of Animal Science and Technology, Anhui Agriculture University, Hefei 230036, China; 3. Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China)

Key words:Canine parvovirus; VP2 gene; prokaryotic expression; immunogenicity

Abstract:According to the genome sequence of CPV SH14 strain, a pair of specifi c primers were designed for amplifying VP2 gene in PCR. The resulting PCR product was digested with BamH Ι and Xho Ι and cloned into pGEX-4T-1 vector to obtain the recombinant plasmid pGEX-4T-VP2. Then, pGEX-4T-VP2 was transformed into E.coli BL21 cells with IPTG induction. The expressed products were identifi ed in SDS-PAGE. Polyclonal antibodies against CPV VP2 were prepared with the purifi ed recombinant VP2 by vaccinating rabbits. The rabbit antibodies were used in Western blot and indirect immunofluorescence to detect their reactivity with the expressed VP2. The results showed that the recombinant VP2 expressed in E.coli BL21 cells reacted positively with rabbit polyclonal antibodies. The availability of the recombinant VP2 has laid the solid foundation for development of subunit vaccine, diagnostic methods and pathogenic mechanism research for CPV.

中图分类号：S852.659.2

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2016）01-0038-06

收稿日期：2015-12-01

基金项目：国家自然科学基金（31270194、31300141）；农业公益性行业科研专项课题（201303046）

作者简介：唐井玉，女，硕士研究生，预防兽医学专业

通信作者：王桂军，E-mail：wgj@ahau.edu.cn；刘光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn