H7N3亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

冯琳琳，滕巧泱，闫丽萍，李雪松，申之义，李泽君

（1. 内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）



H7N3亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

冯琳琳1,2，滕巧泱2，闫丽萍2，李雪松2，申之义1，李泽君2

（1. 内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

摘 要：为建立H7N3亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）A/Duck/Zhejiang/690/2009（H7N3）（ZJ690）、A/Duck/ Zhejiang/766/2009（H7N3）（ZJ766）反向遗传操作系统，本研究采用8质粒系统共转染293T细胞，成功拯救出了R-ZJ690和R-ZJ766 2株病毒。对获救病毒株进行全基因序列的测定，证实获救病毒的序列与亲本毒的序列完全一致。将H7N3亚型AIV亲本毒ZJ690株、ZJ766株和拯救病毒R-ZJ690株、R-ZJ766株均以106EID50剂量经鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠，病毒均引起小鼠的体重下降但不造成死亡，感染后d4，仅在小鼠的鼻和肺中可以分离到病毒。由此可见，R-ZJ690、R-ZJ766与其亲本毒ZJ690株、ZJ766株保持了一致的生物学特性。本研究成功建立了H7N3 AIV ZJ690、ZJ766株的反向遗传操作系统，为H7亚型AIV的致病机理和跨宿主传播机制研究等奠定了基础。

关键词：禽流感病毒；亚型H7N3；反向遗传操作系统

禽流感（Avian Influenza，AI）是由正粘病毒科的A型病毒引起的禽类感染的疾病综合征，根据病毒表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），A型流感病毒可以分为18种不同的HA亚型和11种不同的NA亚型[1]。其中的H5和H7亚型的部分毒株属于高致病性禽流感病毒，其他亚型的禽流感病毒都是低致病性的，不论高致病性禽流感病毒还是低致病性禽流感病毒都可能发生跨宿主感染其他动物，甚至人类。一些对家禽呈现低致病力的禽流感病毒很容易在禽类中存在，因不引起禽的症状而不被注意，但其对人却具有很高的致病力和致死率[2]，低致病性禽流感也可以通过基因重组而获得感染人的能力，并造成人类流感大流行[3]。世界上发生了多次禽流感病毒感染人事件，1959年，从美国的一名男性肝炎患者血液中分离到H7N7病毒[4,5]，1997年，香港首次发生H5N1亚型禽流感病毒感染人事件，造成 18 人感染，其中6人死亡[6]；2013 年，在上海、安徽两地出现急性呼吸道感染患者，后被证实为新型 H7N9 AIV感染[7]，这种新型流感病毒是一种多元重组病毒，其 HA 基因与 H7N3 具有很高的同源性，NA基因与H4N9、H7N9、H11N9 均具有很高的同源性，6个内部基因均来源于 H9N2[8,9]。H7N9感染人的事件发生后，对该亚型病毒进行了广泛研究，但是对提供HA基因的H7N3亚型流感病毒的研究仍然非常有限。

禽流感病毒反向遗传操作系统是研究流感病毒致病性，跨宿主传播机制，以及研制重组疫苗候选株的主要方法之一。本研究建立了2株H7N3亚型禽流感病毒A/Duck/Zhejiang/690/2009（H7N3）（ZJ690）和A/Duck/Zhejiang/766/2009/（H7N3）（ZJ766）的反向遗传操作系统，为该亚型病毒研究提供了技术平台。

1　材料与方法

1.1病毒株、细胞、鸡胚及实验动物 H7N3亚型禽流感病毒ZJ690，ZJ766毒株由本实验室分离并保存；293T细胞在含10%FBS的DMEM的培养液中，37℃，5%CO2的培养箱中培养，双向表达载体pBD由本实验室提供，9～11日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通试验动物技术有限公司，6周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2主要试剂 病毒RNA的提取试剂盒和转染用的质粒提取的试剂盒购自QIAGEN公司，鼠源反转录酶（M-MLV）试剂盒购自TaKaRa公司，Pfx高保真DNA聚合酶购自Invitrogen公司；小量质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自AXYGEN公司；Klenow大片段酶、BspQI 酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；感受态大肠杆菌DH5α购自北京全式金公司；OPTI-MEM培养基，MEM/EBSS培养液购自Thermo公司；引物由上海桑尼生物公司合成；转染试剂Mirus购于MIRUS公司。

1.3引物的设计 根据2株病毒的基因序列，设计引物（见表1），每对引物上游引物的 5'端增加CC2个碱基，下游引物 5'端增加 TT2个碱基。

表1 本文所使用的引物Table 1 Primers used in this paper

1.4重组质粒的构建 从分离纯化的鸡胚尿囊液里提取ZJ690、ZJ766病毒的RNA，利用流感病毒通用的12 bp引物（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）反转录得到病毒cDNA，利用特异的引物对病毒的各基因片段进行扩增回收。pBD载体及PCR产物的处理方法见文献[10]，将处理好的基因片段和处理好的pBD载体进行16℃过夜连接，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性菌，测序正确后，用Qiagen Endofree Plasmid Maxi Kit提取质粒，并测定其浓度。

1.5拯救病毒 将293T细胞传代时培养到六孔板上，待细胞长到70%～80%时，按每种质粒0.6μg进行混合于250μL的OPTI-MEM中，将15 μL Mirus转染试剂加入到250μL的OPTI-MEM中混匀，静置30 min后，将质粒和转染试剂混合，加入到用OPTI-MEM清洗两次的293T细胞上。48～72h之后加TPCK-trypsin作用2～4h后，将细胞上清接种到9～11日龄的SPF鸡胚，0.2mL/枚，37℃继续孵化48～72h后，进行血凝（HA）试验，收集血凝结果为阳性的尿囊液，分装置于-80℃保存。

1.6获救病毒的各基因序列的测定 提取获救病毒的RNA，RT-PCR扩增出2个病毒的16个基因片段，并对序列测定，比对获救病毒与亲本毒的序列是否一致。

1.7小鼠实验 为研究和比较获救病毒和亲本毒对小鼠的致病性和在小鼠体内的增殖特性，将6 w BALB/ c乳鼠随机分为5组，攻毒组4组，每组10只；空白组5只。在攻毒之前测定记录其体重，干冰麻醉后，以50 μL含 106EID50的病毒经鼻腔接种小鼠，每天测量体重变化，攻毒后4 d，每组剖杀3只，6 d时每组剖杀3只，取鼻甲、肺、脾、肾、脑用于病毒分离、滴定。剩余的4只继续称量体重，观测到d 14后安乐致死，无害化处理。

1.8病毒的分离与滴定 按每脏器加入1 mL 含10倍双抗的PBS的量，在组织研磨离心机内充分研磨，4℃下、10 800×g 离心 10 min，分离上清液，然后用PBS 进行10倍倍比稀释，将不同稀释度的组织研磨液分别经尿囊腔接种3枚10日龄鸡胚，0.1mL/枚，37℃孵化48 h后测定血凝活性，利用 Reed-Muench法计算脏器研磨液中病毒含量（EID50）。

2　结果

2.1病毒各基因片段的扩增 RT-PCR扩增H7N3亚型AIV ZJ690株、ZJ766株的8个基因片段，经1%的琼脂糖电泳鉴定，得到的产物大小与相应的基因大小相符，见图1、2。

2.2重组质粒的构建及病毒拯救 扩增的目的基因片段与pBD载体连接，转化大肠杆菌DH5α。挑取扩大培养的阳性质粒，经测序拼接后，得到序列正确的15个质粒。测序表明ZJ690和ZJ7662个毒株的NA基因序列完全相同。重组质粒传染293T细胞后，成功获得拯救病毒R-ZJ690和R-ZJ766。

2.3获救病毒序列的鉴定 提取获救病毒的鸡胚尿囊液中的RNA，反转录，使用H7N3AIV ZJ690株、ZJ766株的8对特异性引物对病毒各基因片段进行RT-PCR扩增及序列测定，获救毒株与亲本毒的序列完全一致。证明救获病毒的RNA完全源于亲本毒ZJ690株、ZJ766株。

2.4小鼠试验 与对照组相比，拯救病毒与野生病毒均可导致小鼠体重增长缓慢，但不能导致小鼠死亡，见图3。

图3　小鼠感染H7N3 ZJ690，R-ZJ690，ZJ766，R-ZJ766毒株后体重生长曲线Fig. 3 The body weight gain of mice after inoculated intranasally with 106EID50dose of H7N3 ZJ690, R-ZJ690, ZJ766, R-ZJ766 strain

2.5病毒分离滴定 ZJ690、R-ZJ690、ZJ766、R-ZJ766感染小鼠d4，对小鼠实施安乐死，采集肺脏、鼻甲、脑、脾、肾，分离病毒进行病毒滴定。结果显示，小鼠肺脏和鼻甲均成功分离到ZJ690、R-ZJ690、ZJ766、R-ZJ766。而在其他脏器中均未检测到病毒（图4）。

3　讨论

图4　鼻腔感染H7N3 ZJ690，R-ZJ690，ZJ766，R-ZJ766株后小鼠各组织脏器中病毒滴度Fig.4 Virus titration of H7N3 ZJ690, R-ZJ690, ZJ766, R-ZJ766 strain viruses in mice

1902年造成鸡瘟的高致病性病原被证实为H7N7亚型禽流感病毒（A/Chicken/Brescia/ 1902（H7N7））。近年来，高致病性和低致病性的H7亚型禽流感病毒的呈现时间范围流行，包括巴基斯坦、意大利、爱尔兰、德国，荷兰、澳大利亚、智利、加拿大及美国等国家都有不同H7亚型禽流感爆发，导致了超过七千万家禽的死亡，并且，H7的欧亚谱系和北美谱系均有感染人和死亡的报道，提醒我们H7亚型禽流感病毒对公众健康的威胁不容忽视。研究表明，许多H7亚型病毒不需要经过适应便可在实验动物的呼吸道有效复制，且在哺乳动物体内有系统性的播散，包括中枢神经系统[11,12]，H7亚型禽流感病毒对哺乳动物有潜在的大流行可能，对H7亚型禽流感病毒的研究与防控具有重要的公共卫生意义。

我国H7N9感染人的事件发生后，对该亚型病毒进行了广泛研究，但是对提供HA基因的H7N3亚型禽流感病毒的研究仍然非常有限。研究表明，HA的高裂解性和附近糖基化位点的变化是流感病毒对哺乳动物具有致病性的决定性因素。一般高致病力毒株在裂解位点附近都有连续4个以上碱性氨基酸，而低致病性禽流感病毒的HA 裂解位点处一般就只有单个的碱性氨基酸－精氨酸。虽然H7N9与H7N3都是低致病性禽流感，但是H7N9却能够感染人并引起死亡，证明H7亚型禽流感病毒对人类具有潜在致病致死性威胁。本研究利用8质粒系统成功构建了2株H7N3亚型禽流感病毒的反向遗传操作系统，小鼠致病性试验结果证实了救获病毒与野生病毒对小鼠的致病力和增殖部位一致。病毒只在小鼠的呼吸道分布和增殖，在其他脏器内未检测到，小鼠的体重增长缓慢。本研究建立了H7N3 AIV分离株ZJ690 和ZJ766 的反向遗传操作系统，该系统为进一步研究H7N3的致病机理、跨宿主传播机制等提供了操作平台。

参考文献

[1] Zhu X Y, Yu W L , McBride R, et al. Hemagglutinin homologue from H17N10 bat influenza virus exhibits divergent receptor-binding and pH-dependent fusion activities [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(4): 1458-1463.

[2] Wen Y M, Klenk H D. H7N9 avian influenza virussearch and re-search [J]. Emerg Microbes Infect, 2013, 2(5): e26.

[3] Chin P S, Hoffmann E, Webby R, et al. Molecular evolution of H6 influenza viruses from poultry in southeastern China: prevalence of H6N1 influenza viruses possessing seven A/HongKong/156/97 (H5N1)-like genes in poultry [J]. J Virol, 2002, 76(2): 507-516.

[4] DeLay P D, Casey H L, Tubiash H S, Comparative study of fowl plague virus and a virus isolated from man [J]. Public Health Rep, 1967, 82(7) ; 615-620

[5] Campbell C H, Webster R G, Breese S S, Fowl plague virus from man [J]. J Infect Dis, 1970, 122(6): 513-516.

[6] Claas E C, Osterhaus A D, Van Beek R. Human influenza H5N1 virus related to a highly pathogenic Avian influenza virus [J]. Lancet, 1998, 351(9101): 472-477.

[7] Gao R B, Cao B, Hu Y W et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus [J]. N Engl J Med, 2013, 368(20): 1888-1897.

[8] Jian Z, Deng G H, Liu P H, et al. Isolationand characterization of H7N9 viruses from live poultry market Implication of the source of current H7N9 infection in humans[J]. Chin Sci Bull, 2013, 58(16): 1-7.

[9] Zhang Q Y, Shi J Z, Dong G H, et al. H7N9 influenza viruses are transmissible in ferrets by respiratory droplet [J]. Science, 2013, 341(6144): 410-414.

[10] 范俊, 李旭勇, 王金良, 等. 7.2 分支 H5N1 亚型禽流感病毒反向遗传疫苗候选株的构建[J]. 中国预防兽医学报，2013, 35(9): 764-766.

[11] Belser J A, Lu X, Maines T R, et al, Pathogenesis of avain influensa (H7) virus infection in mice and ferrets: enhanced virulence of Eurasian H7N7 viruses isolated from humans[J], J Virol, 2207, 81(20): 11139-11147.

[12] Wit E,Munster V J, Spronken M I, et al, Protection of mice aganiest lethal infection with highly pathgentic H7N7 influenza A virus bu using a recombinant lowpathogenicity vaccine strain[J], J Virol, 2005, 79(19): 12401-12407.

·研究论文·

ESTABLISHMENT OF REVERSE GENETIC SYSTEM FOR H7N3 AVIAN INFLUENZA VIRUSES

FENG Lin-lin1,2, TENG Qiao-yang2, YAN Li-ping2, LI Xue-song2, SHEN Zhi-yi1, LI Ze-jun2

(1. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Key words:Avian infl uenza virus; H7N3; reverse genetic system

Abstract:In the present study, the reverse genetics systems of A/duck/Zhejiang/690/2009(H7N3) (ZJ690) and A/duck/ Zhejiang/766/2009/(H7N3) (ZJ766) were established. After 8 plasmids were co-transfected into 293T cells, two viruses were rescued and named as R-ZJ766 and R-ZJ690. Sequence analysis confi rmed no unexpected mutations in the genome of two rescued viruses. To test the pathogenecity of wild-type and rescued viruses in mouse, each of 10 six-week-old BALB/c mice were inoculated intranasally with 106EID50of viruses. Four viruses (ZJ690、ZJ766、R-ZJ690、R-ZJ766) did not kill any mice but all viruses caused weight loss. All viruses were recovered only from the nasal turbinates and lungs of the inoculated mice, suggesting the rescued viruses possessed the same biological characteristics as wild-type viruses. The establishment of the reverse genetics system of two H7 viruses would support the further study on the pathogenic and interspecies transmission of H7 Avian infl uenza virus.

中图分类号：S852.659.5

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2016）01-0027-05

收稿日期：2015-04-07

基金项目：自然科学基金（面上）项目（31472206）

作者简介：冯琳琳，女，硕士研究生，预防兽医学专业

通信作者：申之义，Email：nmszy1958@163.com；李泽君，Email：lizejun@shvri.ac.cn