山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、序列分析及原核表达

鲍长磊，何亚鹏，张　琪，许信刚，张彦明，付明哲

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌　712100)



山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、序列分析及原核表达

鲍长磊，何亚鹏，张琪，许信刚，张彦明，付明哲

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌712100)

摘要根据GenBank已登录的GTPV基因组序列，设计并合成1对特异性引物，以GTPV疫苗株基因组DNA为模板，PCR扩增获得 ORF103基因片段并进行序列分析，再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中，构建重组质粒pET- ORF103，经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达，并进行SDS-PAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株 ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35 ku的重组蛋白，该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合，具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料，并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。

关键词山羊痘病毒； ORF103基因；基因克隆；序列分析；原核表达

山羊痘(Goatpox)是由山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)引起山羊的一种高度接触性传染病，主要以发热、呼吸困难、流黏液性或脓性鼻液及在皮肤黏膜出现痘疹为特征，病死率较高，能造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易和养羊业的发展[1-3]。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为必须通报的动物传染病，中国将其列为一类动物疫病。GTPV属痘病毒科(Poxiridae)山羊痘病毒属(Capripoxvirus)，是在细胞浆内复制的有囊膜的双股DNA病毒，共有147个开放阅读框(ORF)，其序号按照1条单链5′到3′的顺序依次编号为001～156[4-5]。该基因组结构在功能上分为2部分，其中心区( ORF024～ORF123)构成1部分，包含与其他痘病毒同源的保守序列，编码病毒复制所需的蛋白，主要在病毒的转录、RNA修饰、DNA复制以及病毒粒子组装等过程中发挥作用[6]。另1部分则由2个末端基因组区组成( ORF1～ORF23和 ORF124～ORF156)，由一些推测可能具有毒力和宿主范围的基因组成[7]。 ORF103分布在基因组的保守区，为病毒粒子核心蛋白，在病毒颗粒组装过程中发挥重要作用[8]。本试验对山羊痘 ORF103基因进行克隆，并应用生物学软件预测ORF103蛋白氨基酸序列的信号肽、跨膜结构域、疏水性、抗原指数和表面分布可能性，以期了解ORF103蛋白的分子结构特征，为探究山羊痘病毒分子生物学及其装配机制奠定基础;其次构建GTPV ORF103基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌系统中诱导表达，为下一步研究GTPV血清学诊断抗原奠定基础。

1材料与方法

1.1材 料

1.1.1病毒、菌种和质粒山羊痘病毒(GTPV)弱毒疫苗株AV41为山东绿都生物科技有限公司产品；pEASY-T1 Cloning Kit、感受态细胞Trans5a、BL21为北京全式金生物技术有限公司产品；pET-28a质粒由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室保存。

1.1.2主要试剂各种内切酶、T4DNA连接酶购于NEB公司；2×EsTaqMasterMix、DL2 000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、广谱蛋白Marker购于北京康为世纪生物科技有限公司；Blue plus Ⅱ Protein Marker购自北京全式金生物技术有限公司；血液/组织/细胞基因组提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；IPTG购自Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3血清GTPV阳性血清为采自临床免疫过GTPV弱毒疫苗株AV41的羊血清。

1.2方 法

1.2.1引物设计与合成根据GenBank中登录的山羊痘病毒基因组序列(AY077835.1)，通过NCBI ORF Finder工具查询 ORF103基因序列，利用Premier 5.0设计 ORF103的特异性引物(ORF103-F/ORF103-R)，上游引物:5′-CGCGGATCCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG-3′(下划线为BamHⅠ酶切位点)；下游引物:5′-CCGCTCGAGATCCATACCATCGTCGATAG-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)，扩增片段长度为570 bp，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2病毒基因组DNA的提取取200 μL稀释的弱毒疫苗，根据血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取病毒基因组DNA，-20 ℃保存，备用。

1.2.3 ORF103基因的扩增以提取的GTPV基因组DNA为模板，50 μL PCR反应体系：2×ESTaqMastermix 25 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，灭菌ddH2O 21 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。胶回收 ORF103目的片段，连接至pEASY-T1载体并转化克隆感受态细胞，培养并PCR鉴定，提取阳性质粒并命名为pEASY-T1-ORF103。

1.2.4原核表达载体pET- ORF103的构建BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pEASY-T1-ORF103及pET-28a空质粒，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切产物。T4连接酶将回收的 ORF103目的片段与线性化pET-28a质粒于4 ℃连接过夜。将连接产物转化克隆感受态细胞Trans 5α中。挑取单克隆后扩大培养，分别进行PCR和双酶切鉴定后送华大基因(北京)测序，测序正确的重组质粒命名为pET- ORF103。

1.2.5 ORF103的序列分析及编码蛋白的结构预测利用NCBI BLAST功能将 ORF103 测序结果与GenBank已收录的羊痘病毒基因组DNA序列( KC951854.1、AY077836.1、AY077835.1、AF325528.1 AF409137.1、AY077832.1、AF409138.1、AY077834.1、AY077833.1)进行比对。利用Internet在线软件预测 ORF103编码蛋白的信号肽 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和跨膜区(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。利用DNA Star软件预测分析蛋白的亲水性、抗原指数和表面分布可能性。

1.2.6重组蛋白ORF103的诱导表达及表达条件优化将鉴定为阳性的重组质粒pET- ORF103和pET-28a空载体分别转化表达感受态细胞BL21，挑取单克隆，37 ℃、220 r/min过夜培养，按φ=1% 转接5 mL新鲜LB培养基后，培养至对数期(约3～3.5 h)，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，诱导5 h后收集1.5 mL菌液的菌体，100 μL PBS洗涤1次后用100 μL PBS重悬，超声裂解30 min。加入100 μL 2×Loading Buffer混匀，沸水浴10 min，12 000 r/min离心10 min，取5 μL上清进行SDS-PAGE。

其他条件不变，摸索不同IPTG终浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)和不同诱导时间(3～6 h)对重组蛋白表达的影响，优化重组蛋白表达的条件。

1.2.7重组蛋白ORF103表达形式分析在最佳诱导条件下，分别取菌液上清、菌体超声裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析重组蛋白的表达形式。

1.2.8ORF103蛋白的Western blot分析将重组蛋白表达产物进行常规SDS-PAGE后，250 mA恒流转膜2.5 h。以50 g/L脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h后，以1∶500倍稀释的山羊痘阳性血清4 ℃孵育PVDF膜过夜。TBST振荡洗涤3次，每次15 min。将PVDF膜以1∶5 000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG抗体室温孵育2 h，TBST振荡洗涤3次，每次15 min。ECL反应液孵育PVDF膜，暗室压片曝光。同时设立阴性对照。

2结果与分析

2.1PCR扩增结果

以GTPV弱毒疫苗株AV41提取的基因组DNA为模板，PCR扩增得到570 bp的 ORF103基因片段，与预期大小相符(图1)。

2.2原核重组质粒的鉴定

重组质粒pET- ORF103经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，同时双酶切pET-28a载体作阴性对照，琼脂糖凝胶电泳后出现570 bp的目的条带和5 369 bp的载体条带，载体条带与阴性对照大小相同，目的条带与PCR鉴定相符，说明重组质粒构建正确(图2)。

2.3 ORF103的序列分析及编码氨基酸的结构预测

NCBI BLAST后发现 ORF103测序结果与GenBank已收录的羊痘病毒基因组DNA序列(KC951854.1、AY077836.1、AY077835.1、AF325528.1 AF409137.1、AY077832.1、AF409138.1、AY077834.1、AY077833.1)相似性在97%以上，表明GTPV的 ORF103基因较为保守。利用Internet在线软件预测ORF103氨基酸序列，结果表明该氨基酸序列没有信号肽(图3)和跨膜区(图4)。利用DNA Star分析ORF103多肽氨基酸序列的亲水性、抗原指数和表面分布可能性，结果见图5。

M. DNA marker DL2000；1. ORF103扩增产物Amplification of ORF103

图1 ORF103基因的扩增

Fig.1Amplification of ORF103 gene by PCR

M. DNA marker DL10000；1. pET-28a 经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET-28a digested usingBamH ⅠandXhoⅠ；2. pET- ORF103经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET- ORF103 digested usingBamHⅠandXhoⅠ；3.PET- ORF103 PCR鉴定 Identification of pET- ORF103 by PCR

图2重组表达质粒的双酶切鉴定

Fig.2Digestion identifications of recombinant plasmid

图3　信号肽预测

图4　跨膜区预测

图5　ORF103蛋白序列的亲水性、抗原指数和表面分布可能性分析

2.4重组蛋白诱导表达条件的优化

其他条件不变，使用不同浓度的IPTG诱导重组蛋白的表达，结果显示当IPTG终浓度为1 mmol/L时，重组蛋白ORF103表达量最大(图6)；在不同诱导时间(3～6 h)下，结果显示在诱导6 h后，重组蛋白ORF103表达量显著增加(图7)。pET-28a空质粒对照组和pET- ORF103未诱导对照组均没有重组蛋白的表达。

M. 蛋白分子质量标准Protein marker；1. 诱导pET-28aInduced cells containing pET-28a；2. 未诱导pET- ORF103 Uninduced cells containing pET- ORF103；3～7. 分别用终浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG诱导pET- ORF103 Cells containing pET- ORF103 induced with 0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 mmol/L IPTG, respectively

图6不同浓度IPTG对ORF103重组

蛋白诱导表达的影响

Fig.6Effects of different IPTG concebtration on

expression of ORF103 fusion protein

M. 蛋白分子质量标准Protein marker；1. 诱导pET-28a Induced cells containing pET-28a；2. 未诱导pET- ORF103 Uninduced cells containing pET- ORF103；3～7. 分别诱导3，4，5，6 h的pET- ORF103 Cells containing pET- ORF103 induced for 3, 4, 5 and 6 h，respectively

图7不同诱导时间对ORF103

重组蛋白诱导表达的影响

Fig.7Effects of different induction time on

expression of ORF103 fusion protein

2.5重组蛋白ORF103表达形式的分析

在最佳诱导条件下，分别取菌液上清、菌体超声裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE，结果显示重组蛋白ORF103以包涵体的形式存在(图8)。

2.6重组蛋白的Western blot分析

Western blot结果显示，ORF103重组蛋白能与山羊痘阳性血清发生特异性反应出现特异性条带，而与阴性对照转染空载体pET-28a的重组菌不反应(图9)。

M. 蛋白分子质量标准Protein marker；1. 菌液上清Supernatant of lysogeny broth；2. 菌体裂解上清Soluble lysates；3. 菌体裂解沉Insoluble lysates

图8ORF103重组蛋白表达形式分析

Fig.8Form of expression of ORF103 fusion protein

M. 蛋白分子质量标准Protein marker；1. ORF103重组蛋白ORF103 fusion protein；2. pET-28a对照菌pET-28a control

图9ORF103重组蛋白的Western blot结果

Fig.9Western blot analysis of ORF103 fusion protein

3讨 论

本研究成功克隆GTPV疫苗株AV41 ORF103的全长基因，并将其与NCBI上登录的其他GTPV毒株的 ORF103基因进行核苷酸序列比较分析。结果表明，该疫苗株与其他GTPV毒株的核苷酸序列相似性超过97%，其中与中国福建分离株FZ毒株同源性最高，核苷酸同源达100%，表明GTPV的 ORF103基因较为保守。利用在线生物软件预测ORF103蛋白序列，分析表明ORF103蛋白没有信号肽序列和跨膜结构域。氨基酸抗原性和亲水性分析表明，ORF103具有较强的抗原性和亲水性。且抗原性峰值和亲水性峰值基本同步。 ORF103基因编码的蛋白具有良好的抗原性，成为临床上诊断GTPV感染的理想抗原，必将在GTPV的诊断及血清学调查中发挥巨大作用。

大肠埃希菌表达系统具有方便、高效、简单、可操作性强等优点。虽然表达产物无法进行正确的糖基化修饰及容易形成不溶性包涵体，但应用于与功能活性无关的免疫学研究仍然十分理想[9]。本试验将 ORF103基因克隆于pET-28a原核表达载体T7启动子的下游，与His-tag同框融合，构建pET- ORF103原核表达载体，并在宿主菌BL21中成功诱导表达GTPV ORF103蛋白。表达的分子质量约为35 ku，与预期结果相符，这也与李慧霞等[10]原核表达的ORF103蛋白大小一致。

羊痘分布范围很广，主要分布于非洲、亚洲、印度次大陆、欧洲部分地区。该病在中国的广东、广西、江苏、贵州、甘肃、山东、浙江、黑龙江等地均有发生，部分地区呈暴发性流行[11]。羊痘对流行区的养羊业造成很大危害，但目前尚没有方便、有效的检测方法用于畜产品的国际贸易和羊痘的流行病学检测。虽然山羊痘血清学诊断技术很多，比如琼脂凝胶扩散试验(AGP)、对流免疫电泳技术(CIE)、荧光抗体技术(FAT)、反向间接血凝试验(RPHA)和正向间接血凝试验(IHA)[12]。但是这些方法都存在一定局限性，或操作不方便，或特异性不强，或敏感性不高。近年来，ELISA 方法因其操作方便、快速、敏感、特异性强、便于自动化，现已被广泛应用于各种病原抗原或抗体的检测。本试验利用大肠埃希菌成功表达ORF103蛋白，Western blot结果显示表达的ORF103蛋白能与羊痘阳性血清特异性结合，表明表达的ORF103蛋白具有很好的反应原性，可以作为ELISA诊断试剂盒的候选抗原，为后续ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。

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Received 2015-12-06Returned2015-12-21

Foundation itemScientific and Technological Projects of Shaanxi Province(No.2015NY162)；Technology Achievement Project of Demonstration Station (Base) of Northwest A&F University(No.TGZX2015-32).

First authorBAO Changlei,male,master student.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:1250038797@qq.com

ZHANG Yanming,male,Ph.D,professor.Research area:microbiology and immunology. E-mail: zhangym@nwsuaf.edu.cn

(责任编辑：顾玉兰Responsible editor:GU Yulan)

Cloning, Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of ORF103 Gene of Goatpox Virus Vaccine Strain

BAO Changlei,HE Yapeng,ZHANG Qi,XU Xingang,ZHANG Yanming and FU Mingzhe

(College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

AbstractAccording to the published sequence of ORF103 gene of GTPV, a pair of specific primers were designed and synthesized. The ORF103 gene was amplified by PCR from goatpox virus vaccine strain. ORF103 gene sequence was analyzed and cloned into pET-28a vector. The prokaryotic expression plasmid pET- ORF103 containing ORF103 gene was successfully constructed. The expression of recombinant plasmid pET- ORF103 in BL21 was induced and detected by SDS-PACE and Western blot analysis. ORF103 gene was successfully obtained. SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein had molecular weight of about 35 ku by IPTG induction. Western blot analysis showed that the fusion protein had well reactiongenicity. These results provide basic information of ORF103 gene and protein in goatpox virus vaccine strain. Further more, the ORF103 protein can be used to prepare GTPV antibody detection kit.

Key wordsGoatpox virus； ORF103 gene；Gene clone；Sequence analysis；Prokaryotic expression

收稿日期：2015-12-06修回日期：2015-12-21

基金项目：陕西省科技攻关(2015NY162)；西北农林科技大学试验示范站(基地)科技成果推广(TGZX2015-32)。

通信作者：付明哲，男，硕士，高级兽医师，研究方向为羊病学。E-mail：286567031@qq.com

中图分类号S852. 61

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)04-0502-06

Corresponding authorFU Mingzhe, male,master,senior veterinary officer.Research area: sheep disease. Email:286567031@qq.com

网络出版日期：2016-04-02

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.008.html

第一作者：鲍长磊，男，硕士研究生，研究方向为分子病原学与免疫学。E-mail：1250038797@qq.com

张彦明，男，博士，教授，研究方向为分子病原学与免疫学。E-mail：zhangym@nwsuaf.edu.cn