地塞米松对异丙肾上腺素所致小鼠急性心肌损伤及脾脏T细胞亚群的影响

张严高　余　磊　王建莉　朱闽湘　尹戴佳佳

13093795532@163.com



地塞米松对异丙肾上腺素所致小鼠急性心肌损伤及脾脏T细胞亚群的影响

张严高1余磊2王建莉2朱闽湘3,*尹戴佳佳1

13093795532@163.com

【摘要】目的：观察地塞米松(DEX)对异丙肾上腺素(ISO)致小鼠急性心肌缺血损伤的影响，并探讨其作用机制。方法：16只昆明种小鼠随机分成正常对照组(CON组)、ISO组、DEX预处理组(DEX+ISO组)、DEX后处理组(ISO+DEX组)，每组各4例。ISO组腹腔注射ISO(5mg/kg)，1次/天，连续3天；DEX+ISO组于ISO注射前30min腹腔注射DEX(1.25mg/kg)，连续3天；ISO+DEX组于实验第2天和第3天腹腔注射ISO后30min，再腹腔注射DEX(1.25mg/kg)；CON组腹腔注射等量生理盐水，连续3天。实验第4天，各组小鼠心脏采血检测血清谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)；摘取心脏进行HE染色，观察各组心肌组织形态学改变；摘取脾脏，流式细胞术检测脾组织匀浆T细胞亚群分布。结果：(1)与CON组比较，ISO组AST、LDH、CK均显著升高(P<0．01)；心肌组织损害明显加重(P<0．01)；脾组织CD8+、CD4+CD69+T细胞表达上升(P<0．05，P<0.01)。(2)与ISO组比较，DEX+ISO组AST、CK、LDH、CK-MB均下降(P<0．05或P<0.01)；心肌组织损害明显改善(P<0．01)；脾组织CD4+、 CD8+T细胞表达显著下降(P<0．01)，CD4+CD69+T细胞表达显著上升(P<0．01)。(3)与ISO组比较，ISO+DEX组CD8+T细胞表达下降(P<0．05)，其余均无明显变化(P>0．05)。结论：DEX预处理可以明显改善ISO致小鼠急性心肌缺血损伤，其作用机制可能与DEX介导的T细胞亚群免疫应答功能改变有关。

【关键词】地塞米松;异丙肾上腺素;心肌损伤;CD4+;CD8+;CD69+；小鼠

1材料与方法

1.1实验动物、药品及主要试剂和仪器

昆明种小鼠，雄性，体质量20-22g，浙江大学实验动物中心提供[合格证号2007000580817，许可证号SCXK(沪)2012-0002]。ISO注射液(上海禾丰制药有限公司，批号131003);DEX注射液(湖北天药药业股份有限公司，批号1408231)。谷草转氨酶(AST) 检测试剂盒(北京执诚公司, 批号ZCAPRN012)；乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(批号3102511)；肌酸激酶(CK)检测试剂盒(批号403281A)；肌酸激酶同功酶(CK-MB)检测试剂盒(批号404213D)均为北京利德曼公司产品。全自动生化分析仪(日本日立公司,7180型)。流式细胞仪(美国Becton Dickinso公司)；Anti-CD4 FITC antibody(美国Ebioscience公司，克隆号RM4-4，批号E00087-1632)；Anti-CD8a APC antibody(美国Ebioscience公司，克隆号53-6.7；批号B177121)；Anti-CD69 PE antibody(美国Ebioscience公司，克隆号H1.2F3， 批号B177121)。

1.2动物分组处理

将16只小鼠随机分为正常对照组(CON组)、ISO模型组、DEX预处理组(DEX+ISO组)、DEX后处理组(ISO+DEX组)，各组均4只。ISO组先行腹腔注射生理盐水(1.25ml/kg)30min后腹腔注射ISO(5mg/kg)，1次/天，连续3天；DEX+ISO组将生理盐水改为DEX 1.25mg/kg腹腔注射，余同ISO组，连续3天；ISO+DEX组在实验第2天和第3天ISO注射30min后再腹腔注射DEX 1.25mg/kg；CON组腹腔注射等量生理盐水，连续3天。

1.3检测指标和方法

实验第4天，各组小鼠用10g/L戊巴比妥钠(50g/kg)腹腔注射麻醉，在超净工作台中进行心脏取血(2ml)后断头处死小鼠，迅速摘取心脏和脾脏。分别测定血清心肌酶学指标AST、LDH、CK、CK-MB水平，观察心脏组织形态学和心肌损伤程度，分析脾组织中T细胞亚群CD4+、CD8+、 CD69+分布。

1.3.1心肌酶学指标血清水平测定:全血以3 500 rpm离心15min，分离血清，转置于-20℃低温冰箱批检。采用临床生化常规方法测定AST、LDH、CK及CK-MB。

1.3.2心脏组织形态学观察和心肌损伤程度分级:离体心脏以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、间断连续切片(厚约5μm)，HE染色，光镜下观察各组小鼠心肌组织学变化。心肌病理损伤程度参照Ro-na等的方法[4]进行分级，0级：心肌细胞排列紧密，横纹清晰，心肌纤维染色均匀，核居中，间质未见血管扩张及炎细胞浸润，组织间隙无水肿，无出血坏死，心外膜、心内膜无异常，计0分；I级：心肌细胞排列稀疏，间质血管扩张及少量炎细胞浸润，肌浆分布不均，心肌间质水肿，无出血，可见心肌散在的点状坏死，主要为凝固性坏死灶，局限在心内膜下，计2分；II级：部分心肌坏死灶呈片状分布，灶间无连接，病变累及心壁全层，间质可见血管扩张及炎细胞浸润，有灶性出血，心肌间质有炎性出血及心肌间质水肿，计4分；III级：心肌广泛性大片坏死，灶间相互连接累及心壁全层，有明显间质血管扩张、水肿、出血及炎细胞浸润，计6分。每只小鼠随机选取3张切片，计算得分均值为该只小鼠所得分值。

1.3.3脾脏组织中T细胞亚群分析：采用流式细胞术进行检测。取离体脾脏剥除表面结缔组织被膜后，在200目不锈钢网中轻轻研磨，PBS液洗涤2次后加Tris-NH4Cl液裂解红细胞，再洗涤并调整细胞浓度为1×106/100μl。取上述各组单个核细胞悬液100μl加入CD4、CD8、CD69荧光抗体，常规设置平行空白对照，4℃避光孵育30min,PBS洗三遍后，用流式细胞仪检测小鼠脾脏单个核细胞的T细胞亚群(杀伤性T细胞即CD4+T、 抑制性T细胞即CD8+T、激活的杀伤性T细胞即CD4+CD69+T、激活的抑制性T细胞即CD8+CD69+T)。

1.4统计学处理

2结果

2.1各组心肌酶学指标比较

单因素方差分析显示各组AST、LDH、CK、CK-MB水平组间差异均有统计学意义(P<0．01)。与CON组比较，ISO组AST、LDH、CK均明显升高(P<0．01)，CK-MB无明显改变(P>0．05)；与ISO组比较， 而DEX+ISO组AST、LDH、CK、CK-MB均明显下降(P<0．05或P<0.01)，ISO+DEX组AST、LDH、CK、CK-MB水平差异均无统计学意义(P>0．05)。见表1。

表1　各组血清AST、LDH、CK、CK-MB水平比较均=4)

注：与CON组比较,1)P<0．01；与ISO组比较,2)P<0．05，3)P<0．01

2.2各组心肌组织病理学改变

HE染色显示，CON组心肌细胞排列整齐、致密，胞质着色均匀，胞核清晰，间质细胞无增生，未见炎性渗出、无水肿(图1A)。ISO组心肌细胞体积增大呈圆形或类圆形，排列紊乱，细胞核固缩深染，血管和心肌细胞之间可见纤维增多、炎性细胞浸润、少许淋巴细胞浸润，少量红细胞外渗，多处见局灶性坏死(肌溶解、核消失或不着色)(图1B)。ISO+DEX组肌纤维间充血水肿明显，可见少许正常肌纤维；多处见肌溶解、核消失或不着色的局灶性坏死，炎性细胞浸润不明显(图1C)。DEX+ISO组心肌损害较ISO组明显减轻，可见残存正常肌纤维明显增多(核圆形、有核仁，胞浆深红色)，局灶性坏死明显减少呈散在点状，肌纤维排列紊乱改善，血管和心肌细胞之间未见纤维增多、炎性细胞浸润、淋巴细胞浸润(图1D)。心肌损伤程度评分定量分析显示，四组总分差异有统计学意义(F=51.67,P<0．01)。 ISO组(4.00±0.00)显著高于CON组(0)(t=12.49,P<0．01)，DEX+ISO组(2.00±0.00)显著低于ISO组和ISO+DEX组(3.50±0.00)(t=6.24、6.10，P<0．01)，ISO+DEX组与ISO组差异无统计学意义(t=1.56,P>0．05)。

2.3各组脾脏组织T细胞亚群分布比较

各组脾脏的CD4+、CD8+、 CD4+CD69+、 CD8+CD69+T细胞流式细胞检测结果见图2、图3、 图4。方差分析显示，四组CD4+、CD8+、 CD4+CD69+T细胞表达差异有统计学意义(P<0．01),CD8+CD69+T细胞表达差异无统计学意义(P>0．05)。ISO组CD8+、CD4+CD69+T细胞较CON组表达上升(P<0．05，P<0.01)，CD4+、CD8+CD69+T细胞表达与CON组差异无统计学意义(P>0.05)。与ISO组比较，DEX+ISO组CD4+、CD8+T细胞表达明显降低(P<0．01)，CD4+CD69+T细胞表达明显上升(P<0．01)。ISO+DEX组CD8+T细胞较ISO组有所下降(P<0．05)，CD4+、CD4+CD69+、CD8+CD69+T细胞表达与ISO组差异均无统计学意义(P>0．05)。见表2。

图2　各组脾脏CD4+、CD8+T细胞表达(流式细胞术，n=4)

图3　各组脾脏CD4+CD69+T细胞表达(流式细胞术，n=4)

图4　各组脾脏CD8+CD69+T细胞表达(流式细胞术，n=4)

表2　各组脾脏T细胞CD4+、CD8+、CD69+表达的比较(均n=4,%)

注：与CON组比较，1)P<0．05,2)P<0．01；与ISO组比较，3)P<0．05，4)P<0．01

[本文图1见封3]

3讨论

目前认为ISO诱导的心肌损伤与心肌相对缺血缺氧、膜通透性改变、氧自由基损伤等有关[5]。AST、CK、LDH水平及心肌病理学改变是评价心肌细胞损害程度的重要指标[6]。本研究采用连续注射ISO使心肌氧化应激剧增促进氧自由基聚集，细胞膜通透性增高，肌浆内的可溶性酶大量释放入血，导致血清心肌酶AST、LDH、CK水平显著升高，心肌局灶性坏死明显，与以往研究[4,6]相符。

研究表明，DEX预处理可减轻缺血再灌注后心肌损伤程度，减少炎性因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、干扰素-α(IFN-α)的表达，使炎症反应控制在一定的水平[7,8]。本文观察了DEX预处理及后处理对急性心肌缺血损伤效应，结果显示，DEX预处理组心肌损伤较ISO组明显减轻，DEX后处理组心肌损伤较ISO组无明显改变，证实DEX预处理对ISO致小鼠急性心肌缺血损伤具有明显保护作用，而损伤后给予DEX治疗则无保护作用。

CD4+T细胞和CD8+T细胞都是炎性T细胞，通过分泌细胞因子来调节机体免疫功能，起到诱导和辅助细胞免疫及体液免疫的作用。CD69于T淋巴细胞激活后最早表达，通过抑制机体炎症反应，调节机体免疫平衡，同时可作为共刺激信号促进T细胞进一步活化和增殖[9]。有研究表明急性心肌梗死患者淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8功能长期严重失调，降低了机体免疫功能，引起心肌损伤和心室重塑[10]；应用外源性生物反应调节剂调节CD3、CD4、CD8表达水平可以辅助治疗[11]。本文流式细胞分析结果显示，ISO损伤后小鼠脾脏组织CD8+和CD4+CD69+T细胞表达均有上升，而且心肌组织有大量炎性细胞浸润，提示这些T细胞参与了心肌损伤的病理过程。经DEX预处理的小鼠脾脏组织CD4+和CD8+T细胞均显著下降，抑制性T细胞CD4+CD69+表达显著上升，心肌炎性细胞减少，表明DEX预处理可能对损伤心肌细胞起到重要保护作用。但另外一种抑制性T细胞 CD8+CD69+T细胞表达无明显变化，对此现象有待进一步观察论证。DEX后处理组只表现为CD8+T细胞表达下降，其余T细胞表达无明显变化。因此认为DEX预处理对免疫功能的改变是其对心肌缺血缺氧保护作用重要机制之一。

综上所述,在ISO所致急性心肌缺血损伤中，DEX预处理可以明显改善心肌损伤,而DEX后处理没有这种作用。该结果提示DEX可预防ISO介导的心肌损伤，其作用机制可能与DEX介导的T细胞亚群免疫应答功能改变有关。同时也为DEX预处理治疗不稳定型心绞痛，尤其是急性心肌梗死超早期应用提供了实验依据。

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张严高(1964-)，男，汉族，主任医师，主要从事老年心血管疾病及疗养保健工作

参考文献

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3张炯，张颖，江潮,等.地塞米松预处理减轻肾缺血再灌注损伤[J].临床肾脏病杂志,2014,14(3):173-176.

4石孟琼,白彩虹,孙桂林,等.开口箭不同提取部位对异丙肾上腺素所致小鼠心肌缺血损伤的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2013,18(12):1 344-1 352.

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7张炯，张颖，江潮,等.地塞米松抗小鼠肾缺血-再灌注损伤的作用研究[J].医药导报,2013,32(12):1 535-1 538.

8方洁,陆勤,王浩,等.糖皮质激素对脑出血大鼠脑水肿的TNF-α影响研究[J].河北医学，2013,19(3):321-324.

9申蓉,李丽珍.CD69与免疫功能的调节[J].国外医学免疫学分册,2004,27(1):24-27.

10戚传平.急性冠脉综合征患者淋巴细胞亚群测定及临床意义[J].中国临床医药研究杂志,2006，152：40.

11苏宏伟,王鹏,齐海亮,等.CD3、CD4、CD8T细胞亚群的表达对治疗结核性胸膜炎的疗效观察[J].河北医科大学学报,2014,35(10):9 301-9 302.

Effects of Dexamethasone on Acute Myocardial Injury induced by Isoproterenol and T Cells in Spleen

ZHANG Yan-gao1， YU Lei2, WANG Jian-li2, ZU Min-xiang3，*,YIN Dai-jia-jia1

1The First Department of Sanatorium, Hangzhou Sanatorium of Nangjing Military Area Command, Hangzhou 310007,China；2Institute of Immunology,Medicine School of Zhejiang University, Hangzhou 310058,China；3Department of Neurosurgery, 117 Hospital of PLA,Hangzhou 310013,China；*Corresponding author

【Abstract】Objective: To investigate potential protective effect of glucocorticoid receptor(GR)agonist dexamethasone(DEX) on isoproterenol(ISO)-induced myocardial injury and the possible mechanism．Method: The sixteen mice were randomly divided into control(CON) group(n=4)，ISO group(n=4), dexamethasone pretreatment(DEX+ISO) group (n=4)and dexamethasone treatment(ISO+DEX) group(n=4).ISO group, DEX+ISO group and ISO+DEX group received 5mg/kg isoproterenol hydrochloride, daily intraperitoneal injection of 1 time, continuous 3 days.DEX+ISO group given dexamethasone(1.25mg/kg)injection by intraperitoneal injection as a pretreatment before treatment 30 minutes. At the 2nd and 3rd day, dexamethasone(1.25mg/kg) was given after ISO injected 30 minutes in ISO+DEX group. The serum AST, LDH, CK, and CK-MB were detected. Myocardial tissue injury was assessed by HE staining.Flowcytometry was adopted to detect the expression of T cell subpopulation.Results: ①Compared with control group，the levels of AST,LDH and CK were significantly increased；the degree of myocardial injury were greatly deteriorated in ISO group(P<0.01);the expression 0f CD8+T cells and CD4+CD69+T cells were greatly increased(P<0.05,P<0.01).②Compared with ISO group ,the levels of AST and CK was significantly reduced(P<0.01);the levels of LDH and CK-MB were reduced(P<0.05);the degree of myocardial injury was greatly improved(P<0.01) in DEX+ISO group; the expression of CD4+T cells and CD8+T cells were significantly reduced(P<0.01),the expression of CD4+CD69+T cells were significantly increased(P<0.01) in DEX+ISO group.③Compared with ISO group ,the expression of CD8+T cells were reduced(P<0.05) and the other wasn't difference (P>0.05) in ISO+DEX group.Conclusion: DEX pretreatment has protective effect against ISO-induced myocardial injury. The mechanism might be the transformation of immune function．

【Key words】Dexamethasone;Isoproterenol;Myocardial injury; CD4+;CD8+;CD69+;Mice Debonera等[1]发现糖皮质激素对肝脏缺血-再灌注损伤具有保护作用，并首次证实地塞米松(Dexamethasone,DEX)通过抑制炎症信号通路减轻实质性脏器缺血-再灌注损伤，为临床提供了新的选择和理论支持。目前研究提示抑制炎症反应可减轻急性心肌缺血损伤，以及DEX预处理对心脏、肾脏缺血-再灌注损伤有早期保护和延迟保护作用[2，3]。但DEX预处理或治疗对急性心肌缺血损伤的影响机制研究较少。本文观察DEX预处理和后处理对异丙肾上腺素(Isoprotereno，ISO)致急性心肌缺血损伤小鼠心肌酶学指标、心肌组织结构和脾脏免疫T细胞的影响，为临床应用的可行性提供实验室依据。

[中图分类号]R542.2

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2016)02-0009-05

第一作者简介：本文

本文2015-12-10收到，2016-01-26修回